生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

植物は100万を超えるとされるさまざまな代謝物を生合成する能力を獲得することで変化する環境に適応してきた．これらの代謝物の中には，植物体内に蓄積し自身の生育や生物的・非生物的ストレスへの対応に関わるもののほか，植物根から土壌中に分泌され，植物根近傍領域である根圏で機能するものも多い．根圏には，糖，アミノ酸，有機酸等の一次代謝産物に加え，植物種に特徴的な特化代謝産物（二次代謝産物）が分泌される．特化代謝産物の中には生物活性が高いものが多く知られており，根圏の微生物コミュニティー（マイクロバイオータ）の形成に関与することが，近年明らかにされた．

本稿では，植物根から分泌される多様な特化代謝産物の中で，ダイズ（Glycine max）根から分泌されるイソフラボンに着目する．イソフラボンは，フラボノイドのB環アリール基が2位から3位へ転位した構造を持ち，その多くはマメ科植物に存在する．イソフラボンは，ケイ皮酸／モノリグノール経路由来のp-クマロイルCoAと酢酸–マロン酸経路由来のマロニルCoAから，chalcone synthase（CHS），chalcone reductase（CHR），chalcone isomerase（CHI），isoflavone synthase（IFS），2-hydroxyisoflavanone dehydratase（HIDH）によって生合成される．ダイズにおいて生合成されたイソフラボンのダイゼインやゲニステインは，イソフラボン配糖化酵素（UDP-glucuronosyltransferase：UGT）やマロニル基転移酵素（MaT）により，配糖化，マロニル化され，液胞に蓄積する．マメ科植物のイソフラボンは土壌中で根粒菌のnod遺伝子発現を誘導する根粒形成のシグナル分子であることが古くから知られており^1），近年，ヒヨコマメ（Cicer arietinum）のO-メチル化イソフラボンがヒヨコマメに共生する根粒菌のnod遺伝子発現を誘導することも明らかにされた^2）．

ダイズ根から根圏へのイソフラボンの分泌にはATP binding cassette（ABC）タイプの輸送体を介したダイゼインやゲニステインの分泌経路と，液胞に蓄積するそれらの配糖体が根細胞外のアポプラストに局在するイソフラボン配糖体特異的なβ-グルコシダーゼ（ICHG）により加水分解される経路がこれまでに報告されている^{3, 4）}．根粒形成が促進される窒素欠乏下においては，イソフラボンの分泌量が10倍程度増加することも示された^5）．

筆者らのグループでは，ダイズを圃場で栽培し，生育期間を通して根圏での代謝物の解析を行った．その結果，イソフラボンは根粒形成が盛んな生育初期では根圏で15 nmol/g soil程度蓄積し，根粒形成が新たに起こらない生育後期においても20 nmol/g soilを超える濃度で蓄積することが見いだされた^6）．この結果から，筆者らはダイズ根圏においてイソフラボンは根粒形成以外の役割もあるのではと推察し，次節で紹介する標品添加実験によってその機能を調べることとした．本稿では，イソフラボンのダイズ根圏での新たな機能をきっかけとして発見したイソフラボン代謝遺伝子クラスターについて紹介する．

根圏における特化代謝産物の機能を調べるために，特化代謝産物の生合成や分泌が低下した変異体が広く利用されている．これらの変異体を用いることで，植物生育への影響を含め根圏での代謝物の機能を解析することができる利点があるが，変異体で特徴的に増加する代謝物の影響なども考慮しなければならず，代謝物の直接的な影響を評価することが難しい．そのため，筆者らは，代謝物の標品を土壌に添加することにより，直接的にその代謝物が根圏微生物に与える影響を調べる方法を確立した^7）．化合物標品を土壌中に添加することにより，根圏に近い環境を人工的に作り出すことができる．プラスチックチューブに入れたダイズ圃場由来の土壌に根圏で蓄積するのと同程度（10～20 nmol/g soil）となるようにダイゼインを3日ごとに添加し，15日後の土壌からDNAを抽出して16S rRNAのアンプリコン解析を行った．ダイゼインを処理した土壌ではコントロールの土壌と比較して細菌叢の構成菌の多様性が低下した．これはイソフラボンのもつ抗菌活性によるものと考えられる．科レベルでは，ダイゼイン処理によりコントロール区と比較して7科が増加，37科が減少し，コミュニティー全体では，ダイゼイン処理土壌の細菌叢はダイズ圃場のバルク土壌（植物根から離れた土壌）と比べて根圏の細菌叢に近づくことが明らかになった．特に，Comamonadaceae細菌の相対存在量はダイゼイン濃度依存的に増加した．Comamonadaceae細菌はダイズ根圏に増加する主要なメンバーの一つである．以上の結果より，ダイズ根圏においてダイゼインは根粒形成のシグナル分子としての機能に加え，Comamonadaceae細菌を増加させダイズ根圏微生物叢を形成する働きを有することが明らかにされた^8）．

ダイゼインの添加により，Comamonadaceae細菌の相対存在量が増加したことから，これらの細菌種がダイズ根圏においてイソフラボンを栄養源としていることが推察される．実際にダイズ根圏では，イソフラボンが微生物による分解を受けることが報告されている^6）．細菌におけるイソフラボン代謝に関する研究の多くは，腸内細菌を対象としており，これまでにダイゼインをジヒドロダイゼイン，テトラヒドロダイゼインを経てエクオールへと変換する代謝経路が明らかとなっている^9）．この腸内細菌による一連の代謝は，反応に酸素を必要としない還元化酵素によって触媒されることから，嫌気的な腸内環境への適応とともに獲得された代謝経路であると考えられる．一方，植物根圏は腸内環境と比較して好気的な環境であることから，腸内細菌による還元的な代謝経路とは異なる，未知の代謝経路によってイソフラボンが分解されると示唆される．そこで，筆者らは新たなイソフラボンの代謝経路の解明に向けて，ダイズ根圏からのイソフラボン分解菌の単離とその代謝遺伝子の同定に取り組んだ．

ダイズの根からComamonadaceaeに属する細菌を単離したところ，本科に属するVariovorax属およびAcidovorax属の細菌においてダイゼイン分解活性を示すいくつかの細菌株が得られた．そこでダイズ根圏細菌によるイソフラボン代謝経路を明らかにするため，これらの分解菌の中からVariovorax sp. V35株（JCM37046）をモデル株として用いて，ダイゼインの添加・非添加条件でのトランスクリプトーム解析を行ったところ，ダイゼイン処理によって発現が上昇するゲノム領域が見いだされた（図1A）．このゲノム領域は酸化酵素や転写因子，ABC輸送体などの代謝関連遺伝子によって構成された遺伝子クラスターを形成しており，ダイゼイン分解活性を持つComamonadaceae細菌株に特異的に見いだされた（図1B）．

図1 Variovorax sp. V35株からのifc遺伝子クラスターの同定

（A）V35株をダイゼイン存在下および非存在下において培養した際の比較トランスクリプトーム解析．ダイゼイン存在下で遺伝子発現が上昇するゲノム領域が見いだされた．（B）Variovorax属単離菌におけるifc遺伝子クラスター保存性．イソフラボン分解活性を示す単離菌に特徴的に，V35株由来のifc遺伝子クラスターと高い相同性を示す遺伝子クラスターが存在した．（C）遺伝子欠損株を用いたifc遺伝子の同定．野生型細菌はダイゼインを完全に分解した一方，ΔifcA変異株ではダイゼイン分解活性が失われた．（D）大腸菌を用いた異種発現酵素によるIFC酵素の機能解析．IFCAによりダイゼインが8-ヒドロキシダイゼインへと変換された（文献10より引用）．

そこで，この代謝遺伝子クラスターに含まれる遺伝子の欠損変異株を作出することで，ダイゼイン分解における機能解析を行った．フラビン含有モノオキシダーゼをコードするifcA遺伝子の欠損変異株では，ダイゼイン分解活性が失われたことから本遺伝子がダイゼイン分解における初発酵素をコードしていることが推測された（図1C）．大腸菌を用いた異種発現酵素の解析により，IfcAはNADPH依存的にダイゼインのA環8位に水酸基を付加することで，8-ヒドロキシダイゼインに変換する触媒活性を有することがわかった（図1D）．また，IfcAはナリンゲニンやアピゲニンなどのイソフラボン骨格ではないフラボノイド類や，イソフラボン配糖体に対しては活性を示さなかった一方で，ゲニステインやグリシテインなどのダイズが根圏に分泌するイソフラボンアグリコンに対して特異的な触媒活性を示すことが明らかになった．グリオキサラーゼをコードするifcB遺伝子の破壊株はダイゼイン含有培地においてIFCAの反応産物である8-ヒドロキシダイゼインが蓄積したことから，IfcBが2段階目の反応を担うことが示唆された．さらに，cupin super familyをコードするifcD1, ifcD2遺伝子の二重欠損株では，ダイゼインの中間代謝産物と考えられる新たな代謝物ピークが見いだされた．精密質量分析およびNMR解析の結果，この代謝物ピークは，2-hydroxy-5-（4-hydroxyphenyl）-4H-pyran-4-oneと同定され，新規のイソフラボン中間代謝産物であることが明らかになった．以上の一連の解析を通じて，ダイズ根圏細菌における酸化的なイソフラボン代謝経路isoflavone catabolism（IFC）遺伝子クラスターを明らかにした（図2）^10）．

図2 明らかになった土壌細菌による酸化的なイソフラボン代謝経路と腸内細菌による還元的代謝経路（図の一部はBiorender.comを用いて作成）

植物根圏に分泌された特化代謝産物はそこでさまざまな生理活性を発揮し，特定の土壌細菌を誘引・忌避することで植物種に特異的な細菌叢の形成に寄与すると考えられている．しかし，こうした特化代謝産物を介した植物–微生物間相互作用に関わる細菌応答とその遺伝的基盤に関してはこれまでほとんど明らかになっていない．そこで，Variovorax属細菌のダイズ根圏環境への適応におけるIFC遺伝子クラスターの生理学的な機能解析を行った．

イソフラボンの生理活性の一つとして抗菌活性が知られている．Variovorax属単離菌株をダイゼインを含有した栄養培地中でin vitro培養したところ，ダイゼイン非分解菌においてはダイゼイン濃度に依存した増殖阻害が認められたのに対し，ダイゼイン分解菌はダイゼイン添加による生育への影響は認められなかった．また，ifcA遺伝子破壊株においては，ダイゼインによって非分解菌と同程度に生育が阻害された．また，V35株はダイゼインを唯一の炭素源とする培地において増殖した一方，ifcA遺伝子破壊株では生育が認められなかった．さらに興味深いことに，さまざまな環境から単離されたVariovorax属細菌のゲノム情報を用いた比較解析では，ダイズやミヤコグサなどのイソフラボンを生産するマメ科植物を単離源とする細菌株に特徴的にIFC遺伝子クラスターが分布していることがわかった（図3）．これらの結果から，IFC遺伝子クラスターはイソフラボンの抗菌活性を無毒化し，さらには炭素源として利用することを可能にすることで，Comamonadaceae細菌のタイズ根圏への適応に寄与すること考えられた．

図3 Variovorax属細菌の比較ゲノム解析

公共データベースより取得したVariovorax属細菌ゲノムを用いてifc遺伝子の系統内分布を調べた．Variovorax属細菌はさまざまな植物の棍圏から単離されているものの，ifc遺伝子はイソフラボンを生産するマメ科植物（ダイズ，ミヤコグサ）を単離源とする細菌株に特徴的に分布していた（文献10より引用）．

ダイズ根圏におけるComamonadaceae細菌と同様に，植物特化代謝産物の影響を受けて根圏に増加する細菌が，その代謝物を利用（資化）する能力を有する現象が，さまざまな代謝産物と根圏細菌の組合わせで近年報告されている．筆者らのグループでは，イソフラボンのほかにもタバコが生産する毒性アルカロイドであるニコチンや，トマトが生産するステロイドアルカロイドであるトマチンに関する研究を進めており，これらの特化代謝産物がArthrobacter属細菌やSphingobium属細菌によって分解されることを明らかにしている^11–13）．また著者らのグループのほかにも，トウモロコシが生産するベンゾキサジノイドやゴマが生産するセサミンの代謝遺伝子が，これらの植物の根圏を単離源とする根圏細菌から同定されている^{14, 15）}．これらの結果から，根圏細菌は特化代謝産物を分解・資化することで宿主植物の根圏環境に適応しており，この適応機構は植物種を超えて広く保存されたメカニズムであることが推察された．

ダイズ根圏細菌から見いだした新たなイソフラボン酸化的代謝経路について紹介した．根圏細菌の有する特化代謝産物を分解・資化する能力は，根圏環境への適応や植物根への定着に関わると推測されており，遺伝子欠損株を用いた解析や複数の代謝能が異なる菌株を組み合わせたsynthetic community（SynCom）の解析は，根圏細菌叢を形成するメカニズム解明の解明に寄与する．さらに，農業上有用な土壌微生物資材の圃場環境での作物根への定着性の向上にも応用できる．また，イソフラボン代謝経路の中間代謝物として生じる代謝物の中には，8-ヒドロキシイソフラボンのように変換前と比べて生理活性の高くなるものや，新規な構造を有するものが含まれる．これらは，植物特化代謝産物と微生物の酵素が「相互作用」して初めて生産される化合物であり，100万種を超えるとされる植物特化代謝産物の多様性をさらに広げること意味する．遺伝子や代謝物レベルから，コミュニティーレベルでの幅広い解析により，根圏特化代謝産物の機能が明らかにされ，植物-マイクロバイオータ相互作用のメカニズム解明や産業への応用に寄与することが期待される．