生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

カルシウムイオン（Ca^2＋）や環状アデノシン一リン酸（3′,5′-cyclic adenosine monophosphate：cAMP）は細胞内セカンドメッセンジャーとして，外部から受け取った情報を細胞内へ伝達する役割を果たす．これら生化学シグナルは，さまざまな生理機能の調節に関わっており，中枢神経系においては，記憶の形成やその維持に重要であることが知られている．したがって，これらシグナルの動態について，高い時空間分解能でリアルタイムに計測・定量することは，学習や記憶といった高次脳機能メカニズムを理解する上できわめて重要である．近年，多光子励起顕微鏡や内視鏡型顕微鏡などの計測技術の進歩により，イメージング技術によって単一細胞レベルの解像度を維持したまま，多数の細胞から蛍光シグナルを同時に検出することが可能となった．本稿では，生体脳におけるCa^2＋とcAMPの動態を観察するための蛍光プローブと生体イメージング技術について概説する．

Ca^2＋は，心筋細胞の収縮制御をはじめ，細胞増殖や細胞死など，さまざまな生理現象の調節に関与している．脳を構成する神経細胞（ニューロン）においても，Ca^2＋は細胞内セカンドメッセンジャーとして，重要な役割を果たしており，ニューロンの成熟やシナプス可塑性，認知機能を調節することが知られている．

多くのニューロンでは，細胞内遊離Ca^2＋濃度は，静止膜電位（約−70 mV）において，約30～100 nMと低い濃度に維持されている．ニューロンが興奮性入力を受け活動電位（約＋30 mV）を発生すると，電位依存性Ca^2＋チャネルやグルタミン酸受容体などを介して細胞外からCa^2＋が流入し，Ca^2＋濃度が細胞体において一過的に10～100倍に上昇する^1）（図1A）．また，生体脳ニューロンでは，神経発火とCa^2＋の上昇との間に強い相関があることが明らかとなっている^2）．そのため，神経科学分野において，ニューロンの発火を計測する手法の一つとして，Ca^2＋の動態を可視化するCa^2＋イメージングが広く用いられている^3）．

図1 細胞内Ca^2＋シグナルと蛍光Ca^2＋センサー

（A）細胞外のCa^2＋は，電位依存性Ca^2＋チャネル（voltage-gated calcium channel：VGCC），AMPA受容体（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor：AMPAR），NMDA受容体（N-methyl-D-aspartate receptor：NMDAR），ニコチン性アセチルコリン受容体（nicotinic acetylcholine receptor：nAChR）等を介して細胞内へ流入する．細胞内のCa^2＋は，原形質膜Ca^2＋-ATPase（plasma membrane calcium ATPase：PMCA），Na^＋–Ca^2＋交換体（sodium–calcium exchanger：NCX）等を介して細胞外に排出される．（B）蛍光Ca^2＋センサーの基本骨格．GCaMPは，円順列型GFP（cpGFP），カルモジュリン（CaM），ミオシン軽鎖キナーゼ（M13）で構成されている．細胞内遊離Ca^2＋濃度が低い状態では，cpGFPの蛍光輝度は低い．活動電位が発生してCa^2＋が結合すると，CaMとM13が相互作用しセンサーに構造変化が生じる．その結果，cpGFPの発色団の環境が変化し，蛍光輝度が増加する．図は文献4より一部改変．

GFP（green fluorescent protein）などの蛍光タンパク質がレポーターとして広く用いられるようになって以来，これら蛍光タンパク質を応用した遺伝子コード型Ca^2＋センサー（genetically encoded calcium indicator：GECI）が開発されるようになった^4）．

現在，神経科学分野で最も使用されている蛍光Ca^2＋センサーは，GCaMPに代表される単色蛍光タンパク質型GECIである^5）．単色蛍光タンパク質型GECIは，円順列型緑色蛍光タンパク質（circularly permuted green fluorescent protein：cpGFP），カルモジュリン，およびミオシン軽鎖キナーゼから構成されている（図1B）．活動電位の発生により細胞内のCa^2＋濃度が上昇すると，カルモジュリンがCa^2＋と結合しその標的であるミオシン軽鎖キナーゼと相互作用することでセンサーの構造が変化し，蛍光輝度が増加する．開発当初は感度が不十分であり，生体脳への応用は不可能だった．しかし複数の研究グループによってGECIの改良が進められ，2光子励起顕微鏡を用いることで生体脳にも応用可能な高感度GECIが開発された^6–9）．また，これらGECIは細胞体だけでなく，樹状突起スパインなどのニューロンの微小構造においても高S/N（signal-to-noise）比でシグナルの検出が可能である．さらに，GECIは数か月以上にわたりニューロンで安定して発現するため，Ca^2＋感受性蛍光色素では困難であった長期的なイメージングも可能となった．その結果，記憶の形成や学習過程における神経活動の変化について，げっ歯類のみならず，コモンマーモセットなどの非ヒト霊長類でも計測できるようになった^10）．

GECIは，緑色蛍光タンパク質を用いたセンサーがこれまでに主流であったが，近年では緑色以外にもさまざまな蛍光タンパク質を骨格とした高感度GECIが開発されている．特に，赤色蛍光タンパク質を用いたGECIは，生体透過性が高い長波長の励起光を利用できるため，脳深部イメージングへの応用が期待されている．また，赤色GECIは緑色蛍光センサーと組み合わせて使用可能であり，多色イメージングへの応用も期待されている．

2011年にCampbellらによって開発されたR-GECO1は，赤色蛍光タンパク質を用いた初の実用的なCa^2＋センサーである^11）．R-GECO1はGCaMPシリーズの構造を応用しており，Ca^2＋が結合するとセンサーの立体構造が変化し，蛍光輝度が増大する．しかし，R-GECO1はS/N比の課題があり，生体脳ニューロンへの応用には限界があった．その後，複数の研究グループによって赤色GECIの改良が進められ，jRGECO1aやXCaMP-Rなどの感度の高いセンサーが開発された^{8, 12）}．筆者らも赤色GECIの開発に取り組み，既存の赤色GECIの変異やペプチド配列を組み合わせたハイブリッド型の高感度Ca^2＋センサー「RCaMP3」を開発した^13）．RCaMP3は，現在赤色GECIで最も広く使用されているjRGECO1aと比較して，生体脳における活動電位に対して約4倍の蛍光変化率を示し，jRGECO1aを大きく上回る性能を持つ．

cAMPはCa^2＋と同様，細胞内セカンドメッセンジャーとして機能し，生体内のさまざまな生理機能の制御に関与している．cAMPはアデノシン三リン酸（adenosine triphosphate：ATP）からアデニル酸シクラーゼによって産生され，ホスホジエステラーゼによって分解される．このような合成と分解を介したcAMP量の調節により，細胞内シグナル伝達が制御されている（図2A）．またcAMPの生成はGタンパク質共役型受容体（G-protein coupled receptor：GPCR）の活性化によっても制御される．神経伝達物質やホルモンなどのリガンドが受容体に結合すると，Gsタンパク質が活性化され，それによってアデニル酸シクラーゼが活性化し，細胞内cAMP濃度が増加する．一方，Giタンパク質が活性化されるとアデニル酸シクラーゼの活性が抑制され，cAMP濃度が低下する．

図2 cAMPの細胞内シグナル伝達経路と蛍光cAMPセンサー

（A） cAMPを介した細胞内シグナル伝達経路．電位依存性Ca^2＋チャネル（VGCC），AMPA受容体（AMPAR），NMDA受容体（NMDAR）等を介して細胞内に流入したCa^2＋は，カルモジュリン（CaM）を介してアデニル酸シクラーゼ（adenylate cyclase：AC）を活性化し，ATPからcAMPを産生する．また，Gタンパク質共役受容体（G-protein coupled receptor：GPCR）を介したシグナル伝達もACの活性を制御する経路として機能する．産生されたcAMPはプロテインキナーゼA（protein kinase A：PKA）を活性化し，その下流でcAMP応答配列結合タンパク質（cAMP response element binding protein：CREB）をリン酸化することで，cAMP応答配列（cAMP responsive element：CRE）に結合して遺伝子発現を制御する．ホスホジエステラーゼ（phosphodiesterase：PDE）はcAMPをアデノシン5′-リン酸（adenosine 5′-monophosphate：5′-AMP）に分解することでシグナルの調節を行う．なお，本図ではcAMP–PKA–CREB経路に焦点を当てているが，Ca^2＋はCaMKIIやCaMKIVを介してCREBのリン酸化にも関与することが報告されており，今後はこれら経路を統合的に理解することが重要となる．（B）蛍光cAMPセンサーの基本骨格．筆者らが開発した蛍光cAMPセンサーcAMPinG1は，円順列型GFP（cpGFP），マウス由来のPKAのcAMP結合領域から構成されている．cAMPが結合すると，センサーの構造が変化し，蛍光輝度が増加する．

cAMPの代表的なターゲット分子は，プロテインキナーゼA（protein kinase A：PKA）である．cAMPがPKAのcAMP結合領域に結合すると，PKAが活性化される．これにより，下流のタンパク質やcAMP応答配列結合タンパク質（cAMP response element binding protein：CREB）などの転写因子へのリン酸化が誘導される．中枢神経系においてはこのシグナル伝達経路は特に重要であり，シナプス可塑性や記憶の形成に大きく寄与することが明らかとなっている^14）．

また，cAMPはPKA以外にも作用し，環状ヌクレオチド依存性チャネル（cyclic nucleotide gated channel：CNGチャネル）を活性化することで神経活動を制御することが知られている．嗅覚系では，鼻腔にある嗅神経細胞の嗅覚受容体に匂い分子が結合すると，アデニル酸シクラーゼが活性化され，細胞内cAMP濃度が上昇する．cAMPがCNGチャネルに結合することでチャネルが開口し，ナトリウムイオン（Na^＋）やCa^2＋が細胞内へ流入する．その結果，嗅神経細胞で活動電位が発生し，電気信号が脳へと伝達される^15）．

上述のように，cAMPは生体内で非常に重要な役割を果たしており，その時空間ダイナミクスを可視化する技術は，さまざまな臓器や生物種の研究において必要不可欠である．そこで筆者らは，生体脳でcAMP濃度変化を高感度かつリアルタイムに検出可能な蛍光センサーの開発を行った．

蛍光cAMPセンサーの基本原理は，前述の蛍光Ca^2＋センサーと同様である．標的分子結合ドメインにcAMPが結合するとセンサーの構造が変化し，それに伴って蛍光輝度が変化する仕組みである（図2B）．生体への応用が可能な高感度cAMPセンサーを開発するためには，cAMPへの親和性と蛍光変化率の向上が必要であった．そこでまず，cAMPに対する親和性を高めるため，さまざまな生物種由来のcAMP結合タンパク質の比較検討を行い，マウス由来のPKAのcAMP結合ドメインが最適であることを明らかにした．次に，蛍光変化率を増大させるため，約250種類の変異体のスクリーニングを行った．その結果，高い親和性（解離定数K_d＝180 nM）を持ち，かつダイナミックレンジが大幅に上昇した緑色cAMPセンサー「cAMPinG1」の開発に成功した^13）．cAMPinG1により，従来可視化が困難であった感覚刺激によって誘導される生体脳ニューロンのcAMP濃度変化を，単一細胞レベルの解像度で検出できるようになった．また，cAMPの変化は数十秒単位であることも明らかとなった．

さらに筆者らは，開発した赤色蛍光Ca^2＋センサーと緑色蛍光cAMPセンサーを用いて，生体脳ニューロンにおけるCa^2＋とcAMPの関係について解析を行った．マウス大脳皮質一次視覚野ニューロンにこれらセンサーを発現させ，2光子励起顕微鏡を用いてin vivoイメージングを行った（図3）．その結果，数百個のニューロンからCa^2＋とcAMPの動態を同時に可視化することに成功した．頭部固定条件下でマウスを強制歩行させたところ，多くのニューロンでcAMP濃度のみの上昇が観察された（Non motion-related cells）．これは，強制歩行によるノルアドレナリン放出とβアドレナリン受容体の活性化によりcAMP濃度が上昇したことを示唆している．一方，一部のニューロンでは，活動電位に伴うCa^2＋上昇に続いてcAMPの上昇が観察された（Motion-related cells）．このcAMPの上昇は，ノルアドレナリン放出とβアドレナリン受容体活性化に加え，Ca^2＋依存的なアデニル酸シクラーゼの活性化によるcAMP産生が寄与しているものと考えられる．以上の結果から，生体脳ニューロンにおいて，活動電位やCa^2＋シグナル，およびGPCR経路を介したシグナル情報は最終的にcAMPに変換されることが明らかとなった．

図3 生体脳におけるCa^2＋とcAMPの同時イメージング

マウス大脳皮質一次視覚野ニューロンにアデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus：AAV）を用いて赤色蛍光Ca^2＋センサーRCaMP3と緑色蛍光cAMPセンサーcAMPinG1を発現させ，2光子励起顕微鏡を用いてin vivoイメージングを行った．頭部固定条件下でマウスを強制歩行させたところ，多くのニューロンにおいてcAMP濃度のみの上昇が観察された（Non motion-related cells）．一部のニューロンでは，活動電位に伴うCa^2＋上昇に続いてcAMPの上昇が観察された（Motion-related cells）．図は文献13より一部改変．

本稿では，細胞内セカンドメッセンジャーであるCa^2＋とcAMPの動態を可視化する蛍光センサーについて概説した．本稿で紹介した蛍光プローブを用いることで，Ca^2＋とcAMPの動態を詳細に解析できるようになり，高次脳機能メカニズムに関する研究は飛躍的に進展すると期待される．また，開発した蛍光センサーは神経科学だけでなく，免疫学，発生生物学，ドラッグスクリーニングなど，さまざまな生命科学分野のイメージングへの応用が期待される．本稿で紹介したイメージング技術の最大の利点は，高い時空間分解能を持つことにある．生体における細胞内情報伝達シグナルの動態について，細胞集団レベルから個々の細胞の微細構造に至るまでリアルタイムで計測することが可能となり，シグナル伝達の理解がさらに深まることが期待される．