生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

Rasスーパーファミリーに属する低分子量Gタンパク質Rabは，約200アミノ酸から成り立ち，その大部分がGTPaseドメインで占められている（図1A）^1）．このGTPaseドメインがRabの活性化状態と不活性化状態の切り替えを担うことで，種々のメンブレントラフィック（小胞輸送）の過程を制御している．Rabが細胞内で機能するには特定のオルガネラ膜への結合が必要であり，C末端領域のシステイン残基へのゲラニルゲラニル基の付加により，膜局在が可能となる．Rab40のサブファミリーでは，例外的にC末端領域にさらにSOCSボックスが存在する．SOCSボックスと足場タンパク質であるCullin5がユビキチンリガーゼ複合体を形成すると，この複合体はRab40の結合分子をユビキチン化し，プロテアソームによる分解を促進することで，メンブレントラフィックに加えてアクチン骨格制御や細胞移動にも関与する^2）．

図1 低分子量Gタンパク質Rabファミリーと関連分子

（A）ドメイン構造の比較．（B）哺乳類Rabファミリーと関連分子の系統樹．

これらの典型的なRabに加えて，アメリカ国立生物工学情報センター（NCBI）のデータベースには，Rabと命名されたカテゴリーの異なる関連タンパク質が複数存在する（図1A）．“高分子量Rab”と呼ばれるRab44, Rab45, Rab46/CRACR2Aは，約600から1000のアミノ酸で構成され，GTPaseドメイン以外に，EFハンドとコイルドコイル（CC）ドメインをN末端領域に持つ^3）．Ca^2＋結合能を有するEFハンドはCa^2＋センサーとして働き，高分子量RabによるCa^2＋依存的なメンブレントラフィックの制御が報告されている．一方，CCドメインは標的オルガネラへの係留因子や，融合に必要なほかの因子の足場として働くと考えられている．また，六つのRab様タンパク質（RabL1～L6）も存在し，これらはRab GTPaseに似たドメインを持つが，C末端領域でのゲラニルゲラニル化修飾を基本的に受けない．このため，Rab様タンパク質は脂質化による膜局在はせず，メンブレントラフィックとは異なる機能（一次繊毛の形成制御など）を担うと考えられている．

RabはRasスーパーファミリーの中で最大のファミリーを形成し，すべての真核生物に保存されているが，その種類数は生物種によって大きく異なっている．出芽酵母では11種類（うち6種類のサブファミリーが進化的に保存，図1B青丸），線虫やショウジョウバエでは約30種類，哺乳類では約60種類のアイソフォーム（ヒト62種類，マウス58種類）が同定されており，それぞれが特異的なメンブレントラフィックを制御すると考えられている（図1B）．本稿では，近年明らかになってきたRabの翻訳後修飾による活性制御や新たなRabの作用機構に焦点を当て，最新の知見と新たな研究の流れを紹介する．

Rabもほかの低分子量Gタンパク質と同様に，GTP結合型とGDP結合型の二つの状態を行き来することで，その活性が制御されている（図2）．グアニンヌクレオチド交換因子（guanine nucleotide exchange factor：GEF）の作用により，Rabに結合していたGDPがGTPへと交換することでGTP結合型となり，輸送対象となるオルガネラの膜に局在する^4）．このとき，RabのスイッチI・II領域やスイッチ間領域にエフェクターが結合できる活性化状態となるため，特定のエフェクターを膜上にリクルートすることで，メンブレントラフィックが進行する．その後，GTPase活性化タンパク質（GTPase-activating protein：GAP）の作用により，Rabに結合したGTPは加水分解され，不活性化型のGDP結合型へと戻ることで，メンブレントラフィックの進行が終結する．GDP結合型のRabは，GDP解離抑制因子（GDP dissociation inhibitor：GDI）と結合することで，ゲラニルゲラニル基を覆った状態で脂質二重膜から細胞質へと移動する．ゲラニルゲラニル基は細胞質では不安定だが，GDIはそれを保護するシャペロンとして安定化させ，Rabの再利用を可能にしている．GDP結合型Rabに対するシャペロンはほかにもRabエスコートタンパク質（Rab escort protein：REP）が知られている．REPは，新規に合成されたRabをゲラニルゲラニル化するRabゲラニルゲラニル転移酵素（Rab geranylgeranyl transferase：Rab-GGT）へ受け渡す働きがある．なお，REPの脂質化修飾Rabと未修飾Rabに対する結合親和性には大差はないが，GDIの結合親和性は未修飾Rabよりも修飾Rabの方がはるかに高く，ゲラニルゲラニル基の安定化に効率よく機能している．また，GDP型に結合する分子としてRabIF（Rab-interacting factor, MSS4とも呼ばれるRab10などのシャペロン）がある．ヌクレオチドを持たないRabは不安定なことが多く，RabIFはヌクレオチドフリーのRabとも結合するため，この状態のRabを安定化するために働くシャペロンではないかと推測されている^5）．

図2 低分子量Gタンパク質Rabによるメンブレントラフィック（小胞輸送）の制御モデル

詳細は本文2節を参照．

従来のRab活性制御のモデルでは，エフェクターと結合するGTP結合型のRabとそうでないGDP結合型のサイクルがメンブレントラフィックを進行させるとされていたが，いくつかのRabではGDP結合型に結合するエフェクターやヌクレオチドの状態に依存しないエフェクターの存在が近年報告されている．たとえば，GDP結合型のRab27Aに結合するcoronin3は，膵臓のβ細胞でインスリン顆粒のエンドサイトーシスを制御している^6）．Rab7のエフェクターであるVPS34は，そのアダプタータンパク質であるp150とともに後期エンドソーム上で複合体を形成するが，Rab7との結合はヌクレオチド状態に依存しないことが報告されている^7）．このようなGTPの結合に依存しないエフェクターとの結合は一部のRabでのみ報告されており，すべてのRabに適用できる制御機構かは現状では明らかではない．

1）リン酸化修飾

Rabの活性や機能の制御には，上述の分子だけでなくさまざまな翻訳後修飾も重要な役割を果たしている．最も一般的なRabの翻訳後修飾にはリン酸化があり，これを担うキナーゼの種類は多岐にわたる．中でも近年注目されているのが，LRRK2と呼ばれるパーキンソン病関連のキナーゼで，Rab10をはじめ10個以上のRabアイソフォームがリン酸化を受ける．LRRK2のリン酸化部位は，スイッチII領域に保存されたThr残基のため，修飾前後でRabと相互作用する分子との結合親和性が変化する．たとえば，GDIとの結合の抑制により，脂質二重膜と細胞質間でのRabのリサイクルが機能しなくなったり，GEFとの結合の抑制により，エフェクターとの結合も不可能となったりする．しかし，一部のエフェクターではリン酸化状態のRabにのみ結合し（Rab8/10とRILPL1/2との結合など），機能に影響を与える場合もある（図2）^8）．

リン酸化修飾部位はスイッチII領域以外にも複数存在しており，Rab7のTyr183のリン酸化はエンドサイトーシス経路に沿ったEGFR（epidermal growth factor receptor）の分解に関与する（ただし，リン酸化が分解に必要あるいは阻害するという相反する報告があり，詳細については今後の研究の進展が待たれる）．LRRK2によってリン酸化されたRabの脱リン酸化にはPPMH1という脱リン酸化酵素が^9），Rab7の脱リン酸化にはやはりEGFRの分解経路で働くことが知られているPTENが関与する．このように，リン酸化と脱リン酸化のサイクルもRabの機能の調節に重要と考えられ，その詳細なサイクル制御機構の解明が次なる課題である．

2）ユビキチン化修飾

ユビキチン化修飾の特徴的な点として，プロテアソームやリソソームなどでRabが分解されることによる活性の「量的な制御」があげられる（図2）．たとえば，神経突起伸長に関与するRab35は，キナーゼの一種であるPRPKを介したユビキチン・プロテアソーム系によって分解を受けると，神経突起伸長が阻害される．しかし，微小管安定化タンパク質MAP1BがRab35の代わりにPRPKと結合すると分解が抑制され，神経突起伸長が正常に行われる^10）．

また，ユビキチン化も上述のリン酸化と同様に，Rabと相互作用分子間の結合に影響を及ぼすことが知られている．ユビキチン修飾酵素RNF115は，Rab1AとRab13で保存されている二つのLys残基をユビキチン化し，GDIとの結合を阻害することでRabの再利用を妨げる．その結果，Rab1Aのユビキチン化は小胞体からゴルジ体への，Rab13のユビキチン化はゴルジ体から細胞膜へ向かうToll様受容体の輸送を阻害する^11）．

3）その他の翻訳後修飾

いくつかのRabアイソフォームでは，ほかにもセロトニル化，AMP化，ホスホコリン化，パルミトイル化などの翻訳後修飾を受けることが報告されている．誌面の都合上，詳細は文献^1）を参照されたい．

Rabがつかさどるメンブレントラフィックの多くは，生命活動の維持に重要な役割を果たすため，これまで約4分の1のRabアイソフォームの遺伝子変異でヒトの遺伝病（神経疾患や色素異常など）が発症することが知られている．また，モデル生物を用いたノックアウト（KO）個体の表現型解析からも，Rabの機能欠損は個体の発生や組織の恒常性維持にまで影響を及ぼすことが明らかになっている^1）．たとえば，Rab1A, Rab6A, Rab11Aといった酵母からマウスまで保存されているRabのサブファミリー（図1Bの青丸）は発生において重要であり，そのKOマウスは胎生致死を示す．酵母や植物にはみられない，動物界で広く保存されたRabアイソフォーム（Rab35など）でも，KOマウスが胎生致死に至ることが報告されている．Rab-KOマウスの表現型は多岐にわたるが，たとえば，Rab39B-KOマウスでは作業記憶や恐怖記憶が損なわれており，未熟な神経突起のスパインとの関連性が指摘されている．実際，Rab39Bは自閉症や早期パーキンソン病を併発するX染色体連鎖性精神遅滞の原因遺伝子産物の一つであり，Rab39B-KOマウスはこれらの神経疾患が引き起こされる分子メカニズムの解明に有用と考えられる．

KOマウスを利用した表現型解析は遺伝子の機能解明や疾患の理解，創薬開発につながることから，すべての遺伝子のKOマウスの作製と表現型解析を目指した国際マウス表現型コンソーシアム（International Mouse Phenotyping Consortium：IMPC）というプロジェクトが進められている（https://www.mousephenotype.org）．代謝，神経系，血液，行動などの24項目にわたる表現型解析において，マウスの遺伝的背景や解析方法を標準化することで結果の再現性を担保しており，論文での報告がないRab-KOマウスの表現型も登録されているので，参考にしていただきたい．

近年のゲノム編集技術の急速な発展により，培養細胞レベルでのRabのKO解析も進められている．当研究室では，以前イヌ腎臓上皮由来のMDCK細胞を用いて，哺乳類が共通して持つすべてのRab-KO細胞株を樹立した^12）．機能が重複したパラログ（Rab1A/Bなど）を同時にKOしていることが特徴であるが，細胞の生存や成長に必要なRab1A/BやRab5A/B/Cの同時KO株は致死になるため得られなかった．これらのRabに関しては，細胞へのオーキシン添加によって標的タンパク質を急速に分解するオーキシン-デグロンシステム（auxin-inducible degron法：AID法）を用いた条件つきKO（CKO）細胞が作製された^13）．Rab5-CKO細胞の解析から，Rab5A/B/Cを同時に欠損させると初期エンドソームが完全に消失し，Rab5が初期エンドソームの形成に必須であることが明らかになった（図3，下図中央）．このようにRab-KOコレクションは，細胞種を統一した状態でオルガネラの形態や分布，極性形成に関わるメンブレントラフィックを網羅的に解析できる．なお，これらの細胞株は，理研バイオリソースセンターから特に制約なく入手可能（RCB5099–RCB5148, RCB6009, RCB6010）であり，ご興味のある方は是非活用いただきたい．

図3 Rab5-CKO細胞内における初期エンドソームの消失

Rab5-CKO細胞をオーキシン誘導体（5-Ph-IAA）で2時間処理してRab5を急速に分解した後，VPS35（初期エンドソームマーカー）およびLAMP2（リソソームマーカー）の免疫染色を行った．オーキシン誘導体処理前のコントロールの細胞ではVPS35陽性の多数のドットが観察されたが（上段），Rab5欠損状態ではVPS35陽性のドットはほぼ完全に消失していた（下段）^13）．一方，リソソームの形態や数はRab5欠損状態でも特に変化はみられなかった．スケールバー，20 μm．

本稿では，Rabの活性制御や機能解析に関する最新の研究を紹介した．細胞レベルでのノックアウトやビオチン化酵素による近接依存性標識法（新規エフェクターの探索）をはじめとしたさまざまな解析手法の発展によって，上記のような新しい知見が得られてきたが，いまだにRabの機能解析では，Rasや一部の代表的なRabの研究で用いられた手法をそのまま適用したものが多いのが現状である．このため，従来の知見が適用できないようなRabアイソフォームに関しては，それらの実験系について再検討の必要性がでてきている．たとえば，Rasなどの低分子量Gタンパク質の機能解析でよく用いられている常時活性化型もしくは常時不活性化型の変異体は，それぞれGTPやGDPとの結合を維持すると一般的に考えられている．常時活性化型はスイッチII領域にある保存されたグルタミンをロイシンへ，常時不活性化型はα1ヘリックスにあるトレオニンまたはセリンをアスパラギンへ変換することにより作製される．しかし，Rab34の常時活性化型とみなされていた変異体は，常にGTPと結合したままではなく，加水分解が起こってしまうことが報告された^14）．このほかにも，一部のRabの機能解析ではGFPなどのタグの付加にも注意しなければならない．上述のとおり，RabのC末端側は脂質化修飾を受けるため，N末端側にタグを付加して機能解析を行うのが標準であるが，N末端タグによるRabの機能への影響はこれまでまったくといってよいほど考慮されていなかった．つい最近，管状エンドソーム（クラスリン非依存性エンドサイトーシス経路に関わるリサイクリングエンドソームの一種）の形成が損なわれたRab10-KO細胞にタグつきのRab10を再発現させても，管状エンドソームの形成は完全には回復しないことが明らかになった^15）．特筆すべきポイントは，GFPだけでなくFLAGタグのような短いペプチドタグでもレスキュー効果は十分にはみられず，タグの長さにかかわらずRab10の機能が損なわれており，野生型細胞では一部dominant negativeな効果も観察された．したがって，従来用いられてきた解析手法をそのまますべてのRabに適用するのではなく，注目するRabやその機能に合わせた解析がこれからは必要と考えられる．今後，このようなテイラーメイド研究によってRabのより正確な機能が明らかになっていくことを期待したい．