生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

ゲノム情報を担う染色体は一個体のアイデンティティの根幹であり，受精に始まる一連の有糸分裂サイクルにおいて安定に維持される必要がある．過去100年以上にわたり，酵母や培養細胞など，比較的単純なモデルを用いて，有糸分裂の主要遺伝子や基本的な仕組みが同定されてきた．しかし，有糸分裂サイクルを俯瞰的にながめると，動物の初期胚分裂（卵割）は体細胞分裂とはきわめて異なる特徴を有している^1）．たとえば，受精卵はきわめて大きく，転写は抑制されている．またDNA複製の仕組みや，細胞周期制御にも違いがある．では，このようにきわめて特殊な特徴を持つ初期胚細胞において，染色体はどのように安定に娘細胞に分配されるのだろうか？

真核生物の有糸分裂期には，微小管から構成される紡錘体が形成される^{2, 3）}．紡錘体は二つの極を持つ紡錘状の構造体で，その中央で複製された姉妹染色分体を捕捉後，左右の極方向にそれぞれ分配する．したがって，2極性の紡錘体が形成されることは，染色体を二つの娘細胞に均等に分配するための前提となる（図1）．中心体は強力な微小管形成中心として働くため，中心体を持つ細胞では，多くの場合，中心体が紡錘体の極となる．中心体を持たない植物細胞や卵母細胞においても，極の幅がやや広がった樽型となるものの，2極性構造の紡錘体が形成される．

図1 二つの主要な紡錘体形成モデル

紡錘体の形成メカニズムは，酵母，線虫，ハエ，カエル卵抽出液，培養細胞などさまざまな種，実験系で研究されてきた．その結果，現在，概念的に異なる二つのモデルが広く受け入れられている（図1）^4）．一つ目はSearch & Captureモデルと呼ばれ，中心体を持つ細胞において提唱された．具体的には，二つの中心体から伸びた微小管が染色体を探し（Search），染色体上の動原体で捕捉（Capture）されることにより，最終的に中心体を両極に持つ紡錘体構造が作られる，というモデルである．二つ目はSelf-organizationモデルと呼ばれ，中心体を持たない，カエル卵抽出液を用いた実験系から提唱された．このモデルでは，染色体近傍から新規に生成された微小管が，複数の分子モーターや微小管結合タンパク質によって，向き，合着，伸長，収束等の制御を受けることにより，紡錘状の構造が形成される．現在では，中心体を持つ細胞においても，程度の差こそあれ，Self-organization（自己組織化）の仕組みが紡錘体形成に関与していると考えられている．

Self-organizationモデルを支える染色体派生の微小管生成シグナルとして，Ran-GTPが報告されている（図2）^3）．Ranは低分子量Gタンパク質のサブファミリーの一つであり，GEF（guanine nucleotide exchange factor）のRCC1によってGTP結合型（Ran-GTP，活性型）に変換される．またGAP（GTPase-activating protein）のRanGAP1によってGTPが加水分解され，GDP結合型（Ran-GDP，不活性型）となる．他の低分子量Gタンパク質サブファミリー（Ras, Rho, Rab, Arf）は複数のファミリータンパク質を持つが，RanサブファミリーはRanの1種類のみであり，RanのGEFもGAPも1種類のみが報告されている^5）．

図2 Ran-GTPによる紡錘体形成モデルとRCC1分解後の表現型

（左図）Ran-GTPの濃度勾配と，Ran-GTPによるSAFの活性化モデル．（右図）コントロール（上段）とRCC1分解細胞（下段）における，NuMAとHURPと微小管像．文献14より一部改変して抜粋．

Ranは核内外輸送に機能することがよく研究されている^6）．RCC1は高度に保存されたクロマチン結合タンパク質であり，RanGAP1は核膜や細胞質に局在するため，核内外でRan-GTPの濃度勾配が形成される．通常，核移行シグナル（nuclear localization signal/sequence：NLS）を含むタンパク質は，細胞質で核内輸送複合体Importin-alpha, betaと結合し，核内に輸送される．核内ではRan-GTPがImportin-betaと結合し，Importin複合体をNLSタンパク質から解離させるため，NSLタンパク質は核内に局在することとなる．

重要なことに，核膜が崩壊する有糸分裂期においても，RCC1は染色体に結合し，RanGAP1の大部分は細胞質に局在するため，染色体を中心にRan-GTPの濃度勾配が形成される^{3, 6）}．紡錘体形成因子（spindle assembly factor：SAF）の多くはNLSを含んでおり，間期の核内外輸送と同じ仕組みで，Ran-GTPにより染色体近傍でImportin複合体から解離させられる．多くの場合，ImportinはSAFのチューブリンや微小管結合能を阻害するため^7），Ran-GTPによるImportinの解離は，SAFを活性化する働きを持つ．Ran-GTPによって制御されるSAFとして，カエル卵抽出液を用いて，最初に報告された遺伝子が，TPX2^8）とNuMA^{9, 10）}である．現在ではその他のNLSを含む因子や，HURPのようにImportin-betaと直接結合するタンパク質も，Ran-GTPによって制御されるSAFとして報告されている．

紡錘体の形成において，染色体派生シグナル（Ran-GTP）と中心体が重要なのであれば，中心体を持たない卵母細胞の減数分裂において，Ran-GTPが紡錘体形成に必須となることは合理的である^11）．一方，Ran-GTPが中心体を持つ体細胞において紡錘体形成に必須かどうかは，意見が分かれている^12）．また実際にFRETプローブを用いて可視化されたRan-GTPの濃度勾配は，染色体近傍に限定されており，染色体から離れた紡錘体極付近で機能するNuMAのようなSAFが本当に細胞内でRan-GTPのみによって活性化されるかどうかは不明であった．

我々のグループでは，特にNuMAに焦点を当て，この問題に取り組んできた．しかし，Ranは間期に核内外輸送に機能するため，Ranの分裂期機能を正しく評価するためには，Ranを分裂期特異的に阻害するアッセイ系が必要となる．そこで我々は，短時間（半減期約20分）で標的タンパク質を分解誘導可能な，オーキシン誘導デグロン（auxin inducible degron：AID）法^13）を，ヒトのHCT116細胞に用い，この難題に挑戦することにした．具体的には，まずCRISPR/Cas9を用いて，タンパク質分解に必要なmAIDタグと可視化に必要なmCloverタグをコードする配列を連結して，RCC1遺伝子の両アリルのC末端領域に組み込み，内在性のRCC1をすべてRCC1-mAID-mClover融合タンパク質（RCC1-mAC）に入れ換えた細胞株を樹立した^14）．そして，微小管重合阻害剤ノコダゾールを用いて，細胞を分裂期前中期に停止させた状態で，オーキシンを添加し，RCC1-mACを分解誘導した（図3）．オーキシンを添加後，90分の間に，RCC1-mACのシグナルは検出できない程度まで減少した．この状況では細胞内に存在していたRan-GTPはRanGAP1により加水分解され，Ran-GDPに変化していると推測される．またImportin-betaはRan-GTPから解離し，再びNuMAと複合体を形成し，NuMAの微小管結合能を阻害していると考えられる．このような状況でノコダゾールを培地から除去し微小管合成を開始させ，その後の紡錘体形成過程とNuMAの局在を生細胞で観察した．すると，RCC1がないにもかかわらず，NuMAは通常どおり紡錘体極に局在した（図3）^14）．また，2極性の紡錘体も形成され，細胞はコントロールとほぼ同じタイミングで分裂期を脱出した．以上の結果から，ヒトのHCT116細胞では，分裂期特異的にRCC1を分解し，Ran-GTPがないと思われる状況においても，NuMAはRan-GTP非依存的に活性化され，紡錘体極に局在し機能することが示唆された^14）．一方，染色体近傍の動原体微小管に局在するHURPは，RCC1の分解により顕著に局在が阻害された（図2）．よって，体細胞においてもRan-GTPは染色体近傍でHURP等のSAFの局在や機能を制御しうる一方，染色体から離れた場所で機能するNuMA等のSAFの局在制御には十分ではないと考えられた^14）．

図3 ヒト培養細胞の分裂期でのRCC1の分解と表現型

コントロール（上段）とRCC1分解細胞（下段）における，RCC1とNuMAの様子．下段矢印はRCC1が分解された細胞を示す．*はRCC1が分解されなかった細胞．文献14より一部改変して抜粋．

また通常，分裂期を脱出すると，核膜が速やかに再形成され，NuMAは核内に観察される（図3上図）．しかし，分裂期特異的にRCC1を分解すると，NuMAは分裂期脱出後，核内に移行できず，細胞は致死となった（図3下図）^14）．以上の結果をまとめると，体細胞においては，Ran-GTPは分裂期の紡錘体形成には部分的に関与するものの必須ではないが，分裂期脱出後の核膜再形成には必須であり，その機能が細胞の増殖に必須となると考えられた^14）．

1）脊椎動物初期胚の紡錘体

受精後，一細胞あたりの染色体DNA量は発生過程を通じて一定であるが，細胞サイズやその他の性質は大きく変動する．実際，動物の受精卵や初期胚細胞は，体細胞に比べきわめて大きく，それに連動して紡錘体のサイズも格段に大きくなる（図4）^1）．では，体細胞で研究された紡錘体形成メカニズムが，初期胚のような特殊な紡錘体形成にも当てはまるのだろうか．

図4 メダカの卵割における紡錘体構造の変化

紡錘体像は文献18より一部改変して抜粋．

現在知られている最大の紡錘体はカエル（Xenopus laevis）受精卵の紡錘体で，その長さは約60 µmに及ぶ^15）（この場合の紡錘体長は中心体間距離ではなく，紡錘体極間距離として測定）．染色体は紡錘体の中央に整列するため，染色体から紡錘体極までの長さは，約30 µmとなる．一般的なヒト培養細胞の分裂期の直径は20 µmであることを考えると，いかに巨大な紡錘体か理解できる．このカエル初期胚の異なる発生ステージの抽出液を用いて，Ran-GTPの紡錘体形成への関与が比較検討されている^16）．興味深いことに，初期胚（Stage 3, 4細胞期）抽出液では，Ran-GTPは紡錘体形成に必須であったが，後期胚（Stage 8，～4000細胞期）ではヒトの体細胞同様に必須ではなかった．これらの結果は，紡錘体形成の仕組みが細胞サイズや発生段階に依存して変化することを示唆するが，細胞抽出液ではなく，実際の初期胚ではどうなのか，またその他の種ではどうなのかは検討されていない．

2）メダカ初期胚紡錘体のライブイメージング

そこで，我々のグループでは，まずカエル同様に巨大な紡錘体を持つと推定されるメダカ初期胚を用いて，CRISPRとライブイメージング，改良型オーキシン誘導デグロン（auxin inducible degron 2：AID2）^17）を組み合わせ，紡錘体構造の変化やRan-GTPの機能について解析を行った（図4）^18）．メダカはヒトともよく似た遺伝子を持ち，遺伝学的操作，近交系としての維持，温度耐性，飼育等にも優れており，カエル初期胚とは異なり透明であるためライブイメージングによる紡錘体観察が可能である．また初期卵割は同一平面で協調的に進行するため，紡錘体の形成や配置制御を同一平面で捉えるのが容易であり，受精から成体まで長時間のライブ撮影も可能である．

まずCRISPR/Cas9を用い，染色体と微小管を可視化可能なノックイン系統を作製した．染色体はクロマチン結合のRCC1にmCherryを融合したもの（RCC1-mCh）で，微小管は構成因子のチューブリンにEGFPを融合したもの（EGFP-α-tubulin）で可視化した．二つの系統を掛け合わせた後，ホモ接合体から受精卵を採取し，スピニングディスク型共焦点顕微鏡（Nikon Ti2-EにYokogawa CSU-W1をつけた顕微鏡）で撮影を行った．すると受精直後の雌性前核と雄性前核の移動，第一紡錘体の形成から，約10時間後の胞胚期まで撮影することに成功した（図4）．胚は撮影後も正常に発生を続け孵化したため，イメージングによる毒性はほとんどなく，生理的な初期胚細胞内動態を捉えることができたと考えられる．

3）初期胚紡錘体の特殊な構造の発見

このように染色体と微小管を同時に可視化した，脊椎動物の長期高解像度初期胚ライブ動画はこれまでになく，さまざまな新しい情報や疑問を提示した．紡錘体の形に注目して解析したところ，卵割の進行に伴い，初期胚紡錘体は劇的に形や長さを変えることがわかった（図4）^18）．また1分間隔のタイムラプス動画からは，紡錘体中央にみられる微小管輝度の高い領域が，分裂期の中期に形成されることや，体細胞とは異なり中心体が紡錘体極から離れることも明らかとなった^18）．

4）メダカ初期胚におけるRCC1の分解と表現型の解析

また我々は，ヒトHCT116細胞と同様に，mAID-mClover-3xFLAGタグ（mACFタグ）を組み込んだメダカノックイン系統の作製に成功し，AID2法によりRCC1-mACFを初期胚で分解することにも成功した（図5）^18）．RCC1を4細胞期に分解すると，初期胚特異的な紡錘体中央構造が形成されず，これまで観察されなかった染色体の分配異常（後期ラギング染色体や，染色体ブリッジ）も観察された（図5）．よって，Ran-GTPは初期胚紡錘体の特殊構造の形成に必須であり，その欠損は染色体分配異常につながると考えられた．ただ，RCC1を分解すると分裂期に入る直前の核のサイズは小さくなり，また形態もいびつになった．したがって，核の形態異常が間接的に分裂期の染色体分配異常を引き起こした可能性も考えられる．Ran-GTPの初期胚機能をより正確に理解するためには，今後，培養細胞同様に，分裂期特異的にRCC1を分解する必要がある．ただ不思議なことに，メダカ初期胚ではノコダゾール処理やその他の異常環境下においても細胞周期チェックポイントが機能せず，卵割は進行し続けた．初期胚細胞は，チェックポイントに依存せず，どのように細胞周期や染色体分配の正確性を保証しているのか，実に興味深い課題である．また，体細胞用の紡錘体構造を示す胞胚期（約2000～4000細胞期）においてRCC1を分解誘導すると，前述のヒト培養細胞の場合と同様に，2極性の紡錘体が形成され，染色体の分配異常はほとんど観察されなかったが，核膜の再形成の欠損が顕著に観察された．これらの結果は，Ran-GTPは初期胚の紡錘体形成には必須であるが，体細胞様の小さな細胞では必須ではないことを示している．また紡錘体の構造や形成メカニズムは，発生過程で変化することも強く示唆している^18）．

図5 AID2法の概略とメダカ初期胚でのRCC1の分解表現型

（左図）AID2法の概略．このシステムでは，mAIDタグを融合した標的タンパク質と，イネ由来のOsTIR1タンパク質を共発現させる．OsTIR1はF-Boxタンパク質であり，ヒトの細胞のSkp1, Cul1とともにE3ユビキチンリガーゼ複合体を構成する．またOsTIR1にはF74G変異が導入してあるため，OsTIR1（F74G）はオーキシンアナログの5-Ph-IAA依存的にmAIDタグを認識できる．よって，mAIDタグは，5-Ph-IAAの添加により，SCF複合体によりポリユビキチン化され，標的タンパク質とともにプロテアソーム依存的に分解される．（右図）4細胞期にRCC1を分解すると紡錘体中央部の特殊構造の形成が異常となり（矢印），染色体の異常分配が観察される．文献14より一部改変して抜粋．

これまで細胞周期や染色体分配，紡錘体形成の仕組みは，酵母に始まり，ヒト培養細胞など体細胞モデルを用いて精力的に研究されてきた．紡錘体は普遍的に形成されることから，紡錘体形成にも普遍的なモデルがあるかと暗に想像していたが，脊椎動物の発生過程をみると，紡錘体の形態やRan-GTPの機能は，細胞サイズ等に応じて柔軟に変化しうることが明らかとなった．一般的に細胞サイズとオルガネラサイズには比例関係があることが知られている．しかし，紡錘体長に関しては上限（upper limit）があり，巨大な初期胚では紡錘体長と細胞サイズの比例関係が崩れており，紡錘体から細胞膜までの距離が長くなっている^15）．このような状況では，紡錘体形成に限らず，細胞質分裂にも特殊な仕組みが要求されるに違いない．低分子量Gタンパク質のRhoは細胞質分裂に機能している．初期胚やその他の特殊なコンテクストに目を向ければ，体細胞で確立されたモデル以外の，低分子量Gタンパク質の新たな機能や概念がみえてくるように思える．