生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

乳がんは女性が罹患するがんの中で最も新規患者数が多く，日本では毎年9～10万人の女性が新たに乳がんの診断を受ける．そのため，乳がんの分子病態の理解と診断・治療法の確立は女性のQOL向上や，男女を問わず社会全体の幸福度向上においても重要である．一方で，乳がんは，数あるがん種の中でも分子レベルでの理解が最も進んでいるものの一つである．乳がんは，主に発現するホルモン受容体や増殖因子受容体の有無によって大きく四つ（または五つ）のサブタイプに分類される（図1A）^1）．最も患者数が多いのはLuminal Aタイプで，全体の約45％を占める．このタイプは，女性ホルモン受容体（HR）であるエストロゲン受容体（ER）とプロゲステロン受容体（PR）を発現するタイプで，これらホルモン依存的に増殖することから，治療はこれらを阻害するホルモン療法が中心となる．Luminal BタイプはHRを発現するが，Luminal Aタイプと比べ増殖能が高く，増殖因子受容体であるHER2（ErbB2/EGFR2）を発現しないタイプ（5％）とHER2を発現するタイプ（20％）に分けられる．HR陰性でHER2が高発現するHER2＋タイプは患者数全体の約20％を占め，治療はHER2に対する分子標的薬である抗HER2抗体やその抗体薬物複合体（ADC）が用いられる．一方，HR（ER, PR）もHER2も発現しないタイプはトリプルネガティブ（TN）タイプと呼ばれ，副作用が比較的強い抗がん剤が治療の中心となり，他のタイプと比べ，治療の選択肢が限られている．最近では，PARP（ポリADPリボースポリメラーゼ）阻害剤や免疫チェックポイント阻害剤（抗PD-L1抗体），抗TROP2-ADC（トポイソメラーゼI阻害剤）などの分子標的薬が承認されたが，適応条件や耐性細胞出現の可能性を考えると，さらなる標的分子の探索とそれに基づく分子標的薬の開発が望まれる．また，TNタイプの乳がん（TN type breast cancer：TNBC）はほかのタイプと比べ，がん細胞の増殖能や浸潤転移能が高い傾向にあり，40歳以下の若い層の患者が多いのも特徴である^2）．

図1 乳がんのサブタイプとMAP1ファミリータンパク質

（A）乳がんのサブタイプ分類．乳がんは受容体の発現の有無により四つまたは五つのサブタイプに分類される．（B） TNBCとLuminal A（ER＋）患者のRNA-seqデータのVolcano plot. 微小管–アクチン結合タンパク質16種のうちMAP1BのみがTNBC患者で有意に発現の亢進が認められた．（C） MAP1ファミリータンパク質のドメイン構造．ヒトMAP1A, MAP1B, MAP1Sの微小管およびアクチン結合ドメイン，翻訳後切断部位を示す．（D） MAP1ファミリータンパク質の乳がん細胞株での発現比較（Immunoblot）．MAP1BはTNBC細胞株と神経芽腫細胞株で高い発現が認められる．TN：triple-negative, LA：Luminal A, HE：HER2＋．α-tubulinとCalnexinはローディングコントロール．（B, D） Inoue et al. J. Cell Biol., 223, e202303102より一部改変．

著者らは，最近，MAP1Bと呼ばれる微小管−アクチン結合タンパク質がTNBCで高発現することを見いだし^3），その機能を明らかにしたので本稿ではその知見を中心に概説する．

TNBCを含め多くのがん種で治療を難しくしている原因の一つが，がんの浸潤転移である．がんの浸潤転移は非常に複雑なプロセスで多様な因子が関与するが，著者らはその中でも細胞運動や浸潤に特に関係が深いアクチンと微小管に結合するタンパク質群に注目した．

アクチンと微小管の両方に結合することが知られるタンパク質16種についてRNA-seqの公的データベースに登録されたTNBCとLuminal A（ER＋）タイプ（図1B），TNBCとLuminal B（ER＋/HER2＋）タイプの患者間，TNBC細胞株MDA-MB-231とLuminal A細胞株MCF7または正常乳腺細胞株MCF10A間での発現量比較を行ったところ^{4, 5）}，いずれの比較においてもMAP1Bと呼ばれるタンパク質のみTNBCで高発現していることを見いだした．MAP1Bは主に発生時の中枢神経系で発現しており，微小管の安定化を介して神経突起伸長を促進することが知られる^6）．MAP1Bは，同じく神経系で主に発現するMAP1A，ユビキタスな発現がみられるMAP1SとともにMAP1ファミリーに分類される．MAP1ファミリーのタンパク質は翻訳後にタンパク質切断プロセシングを受け，重鎖（HC）と軽鎖（LC）に分断され，一部は再び複合体を形成し機能する（図1C）^7）．MAP1AとMAP1BのLCは，それぞれLC2とLC1と呼ばれる．

各サブタイプの乳がん細胞株においてMAP1BとMAP1A, MAP1Sの発現を比較したところ，期待どおり，MAP1BはTNBC細胞株で高い発現が認められた（図1D）．一方，MAP1Aは神経芽腫細胞株のみで，MAP1Sは調べたすべての細胞株で発現していた．興味深いことに，MAP1Bの発現は，がんの浸潤と深い関係が知られるアダプタータンパク質Tks5や膜結合型細胞外基質分解酵素MT1-MMPとよく似たパターンを示した（図1D）．これらのことから，MAP1BはTNBCの高浸潤活性に関与することが予想された．

TNBCの浸潤能にMAP1Bが関与する可能性を検証するため，MDA-MB-231細胞でMAP1B遺伝子破壊（KO）株を作製し，親株とKO株でコラーゲンゲルへの浸潤能を比較した．KO株ではコラーゲンゲルへの浸潤能が親株の50％以下まで低下した（図2A）．

図2 MAP1BはTks5をオートファジーによる分解から保護することでトリプルネガティブ乳がん細胞の細胞外基質分解，浸潤遊走能を促進する

（A）MDA-MB-231細胞のMAP1B遺伝子破壊細胞株はコラーゲンゲルへの浸潤活性が低下する（Inverted invasion assay）．コラーゲンゲルに30 µm以上浸潤した細胞を定量化した．（B）MAP1Bを発現抑制したMDA-MB-231細胞では浸潤突起数と細胞外基質分解が減少する（Gelatin degradation assay）．Cortactin（浸潤突起）と赤色蛍光ゼラチンの共焦点顕微鏡像．浸潤突起の細胞外基質分解活性は赤色ゼラチンの分解により黒いスポットとして観察される．（C）MAP1Bの発現抑制は浸潤突起の成熟・安定化を抑制する（Cortactin-GFP time-laps imaging）．MAP1Bを発現抑制しても浸潤突起（Cortactinドット）は形成されるが，その寿命は著しく短くなる．（D）MAP1Bの遺伝子破壊はオートファジー依存的なTks5の分解を引き起こす（Immunoblotting）．MAP1Bの遺伝子破壊や発現抑制により浸潤突起構成因子Tks5の量が減少する．その減少は，リソソームにおけるタンパク質分解阻害剤や一部のプロテアソーム阻害剤で回復する．MG132, Epoxomicin, Bortezomibはプロテアソーム阻害剤，Bafilomycin, Chloroquine, Leupeptinはオートファジー／リソソーム依存性分解の阻害剤．Inoue et al. J. Cell Biol., 223, e202303102より一部改変．

浸潤能を持つがん細胞は細胞外基質との接着面に浸潤突起（invadopodia）と呼ばれる細胞膜の微細な突起状構造を形成する（図3右上）^8）．浸潤突起は，アクチン重合を制御するCortactin, cofilin, N-WASP, Arp2/3などからなるタンパク質複合体がTks5を介して細胞膜のphosphatidylinositol 3,4-bisphosphate（PI（3,4）P₂）に結合し^9），アクチン重合を促進することで形成される（図3左下）．そこに微小管がリクルートされ，微小管を介した小胞輸送によりMT1-MMPや分泌型細胞外基質分解酵素（MMP2, MMP9）が輸送され，基底膜などの細胞外基質が分解されることで浸潤が進行する^{8, 10, 11）}．

図3 MAP1BによるTNBCの浸潤転移促進機構

TNBCではMAP1B, Tks5, MT1-MMPの発現が亢進しており，それにより浸潤突起の成熟，細胞外基質分解が促進され，TNBCが周辺組織に浸潤する．MAP1Bの発現を抑えると，Tks5のオートファジー依存的な分解が誘導される．すなわち，MAP1BはTks5と複合体を形成し，Tks5を分解から保護する機能を持つ．Inoue et al. J. Cell Biol., 223, e202303102より一部改変．

細胞外基質に見立てた蛍光標識したゼラチン（変性コラーゲン）上に浸潤能のあるがん細胞を播種すると浸潤突起が形成され，ゼラチンの分解が観察される（図2B左上）．MAP1BをsiRNAで発現抑制（KD）したMDA-MB-231細胞では，Cortactinおよびアクチンで標識される浸潤突起の数が有意に減少し，ゼラチン分解能も低下した（図2B）．浸潤突起数の減少が，浸潤突起形成の阻害によるものなのか，浸潤突起の安定性低下による浸潤突起の寿命短縮によるものなのかを明らかにするため，浸潤突起を標識するCortactin-GFPのタイムラプスイメージングを行った．通常，いったん形成された浸潤突起は比較的長時間安定であるのに対し，MAP1Bを発現抑制した細胞では浸潤突起は形成されるものの，短時間で解離，消失した（図2C）．このことから，MAP1Bは浸潤突起の形成には必要ないが，浸潤突起が細胞膜上で安定化し，成熟する過程に必要であることが示唆された．

TNBC細胞においてMAP1Bのプロセシング産物であるMAP1B-LC1の細胞内局在を観察すると，その大部分は細胞質に存在したが，一部は微小管や浸潤突起にも局在した．浸潤突起に局在するMAP1B-LC1が浸潤突起の主要な構成因子であるCortactin, Tks5と結合する可能性を免疫沈降とproximity ligation assay（PLA）により検討したところ，MAP1B-LC1はその両者と結合または近接して存在することが示された．CortactinとTks5はその分子内にそれぞれ一つと五つのSH3ドメインを持つが，MAP1B-LC1はそれらSH3ドメインに結合した．ただし，Tks5の五つのSH3ドメインについては結合能に差があり，N末端から2番目のSH3ドメインにはほとんど結合しないのに対し，4番目と5番目のSH3ドメインには強く結合した．さらに，MAP1B-LC1とCortactin, Tks5の結合は微小管を脱重合するnocodazole，アクチンを脱重合するlatrunculin A処理によって強く抑制された．これらの結果から，MAP1B-LC1は浸潤突起の形成に不可欠な微小管やアクチン繊維の構造依存的にCortactinやTks5と結合することが示唆された．

さらに興味深いことに，TNBC細胞ではMAP1BのKOやKDによってTks5タンパク質の量が有意に減少した（図2D）．このとき，Tks5のmRNA量には変化がみられなかったことから，この変化はTks5タンパク質の翻訳抑制か分解促進であることが示唆された．そこで，細胞内の主要な二つのタンパク質分解経路，プロテアソーム依存性分解とオートファジー／リソソーム依存性分解の阻害剤の影響を検討した．その結果，オートファジー／リソソーム依存性分解の阻害剤では調べた3種の阻害剤すべてでTks5タンパク質量の回復が認められた（図2D）．さらに，オートファジーの進行に必要な因子，ULK1, ATG9A, ATG14LのKDでも同様のTks5タンパク質の量の回復が認められた．これらの結果から，MAP1BはTks5と結合することでTks5をオートファジーによる分解から保護していることが示唆された．

今回，新たに微小管−アクチン結合タンパク質MAP1Bが，浸潤突起の形成と機能に関わるTks5やMT1-MMPとともに，TNBC患者および細胞株で高発現していること，また，その発現を抑制することによりTks5のオートファジー依存的な分解，それに伴う浸潤突起の安定性・成熟低下が誘導され，その結果としてTNBC細胞の浸潤活性が低下する機構が明らかになった（図3）．

MAP1Bは微小管に加えてアクチン繊維にも結合し，両者を架橋する機能を持つことが報告されているが^12），その生理的な意義はあまりわかっていない．今回，MAP1Bがアクチン繊維を主成分としてもつ浸潤突起においてその形成をつかさどる少なくとも二つの因子，CortactinとTks5，と直接結合することを見いだし，その安定性維持に関与することを見いだしたことは，浸潤突起によるがん細胞の浸潤のみならず，神経細胞の軸索伸長に関わる成長円錐の制御機構にも新たな視点を与える可能性が考えられる．

浸潤突起と微小管の関係については，微小管がMMP等の浸潤突起で働くタンパク質や脂質の輸送に働くと考えられているが^{8, 11）}，微小管が浸潤突起に直接挿入されていることを観察した例はきわめて限られており^13），両者がどのように相互作用し，機能しているのかについては依然未解明な点が多い．上述のように，MAP1Bは微小管とアクチン繊維に結合し，両者を架橋する機能を持つことから浸潤突起における微小管とアクチンの協調に働いている可能性が高いと考えられる．MAP1Bの多くの結合パートナー分子とともに今後その機能や制御機構が明らかになることが期待される．

今回は述べなかったが，我々は，MAP1Bの発現がTNBC患者がん組織でも亢進していること，また，MAP1Bの高発現はTNBC患者の無再発生存期間を有意に短縮することも明らかにしている^3）．また，MAP1Bの発現抑制や遺伝子破壊は，in vitroでの細胞増殖能，マウスモデルでの造腫瘍能も抑制する^3）．これらの機構については現在著者らのグループで解析を進めており，近い将来，その結果を報告できることを期待している．本研究がTNBC増悪機構の理解に貢献し，治療薬・診断薬開発など少しでも患者さんの希望につながることを期待する．