生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

「タンパク質は合成が完了してから機能を発揮する」という常識を覆す存在がある．合成途上鎖（新生鎖）でありながら，自身を合成するリボソームに相互作用し，翻訳を一時停止（アレスト）させる（図1a）．そしてリボソームとの複合体の状態で，環境応答のセンサーとして機能し，細胞内環境に応じて能動的に翻訳動態を制御し，細胞の機能調節に積極的に関与する．このような新しい概念をもたらしているのが機能性新生鎖である．機能性新生鎖はこの20年余で散発的に見つかってきたが，その発見例は少数に限られてきた．なぜなら機能性新生鎖は互いに配列の類似性が低く，一般的なBLAST検索などで網羅的に収集することができなかったためである．しかし，多様な細菌種のゲノム配列情報が大規模に集積された近年，その情報を高度に扱えるデータ解析手法が進歩し，機能性新生鎖のような配列でも，どの生物種が持っているのか網羅的に知ることができるようになった．また，クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）技術の進歩により，そのメカニズムについてより正確に捉えることができるようになった．どのような生物種が機能性新生鎖を環境センサーとして利用しているのか．また，モデル細菌で調べられているアレストメカニズムは，細菌界においてどれほど普遍的なものとして捉えることができるのか．本稿では，我々，およびドイツの共同研究グループの成果^1–3）について解説し，細菌が持つ機能性新生鎖の普遍性と多様性について論じる．

図1 機能性新生鎖の生理機能と一時停止配列

（a）機能性新生鎖による翻訳の一時停止とその解消のモデル図．（b）SecMの翻訳一時停止が持続すると下流にコードされるSecAの翻訳開始が促進される（詳細は本文中に記す）．（c）SecM, MifM, VemPの一時停止配列はそれぞれ異なる．一方で，ApcA, ApdA, ApdPはSecMと類似したアミノ酸残基を一部に持つ．

機能性新生鎖の代表例である大腸菌SecMは，タンパク質の分泌・膜挿入装置である「Secトランスロコン」の活性をモニターし，タンパク質分泌の動力源の一つであるSecA ATPaseの翻訳量を制御する（図1b）．その詳細はほかの総説にもまとめられているため^{4, 5）}，ここでは簡潔な紹介にとどめる．secMは下流のsecAとともに，1本のmRNAとして転写される．このmRNAが二次構造を形成すると，secAの翻訳開始領域がその構造の内部にマスクされ，翻訳開始が抑制される．一方，SecM新生鎖がリボソームのpeptidyl transferase center（PTC）やペプチド鎖排出トンネルと相互作用して翻訳アレストを起こすと（図1a），リボソームによって二次構造が壊され，secAの翻訳開始が可能となる（図1b）．SecMはN末端付近にシグナル配列を持っており，Sec経路で分泌されると，新生鎖に加わる引っ張り力（図1a）により翻訳アレストが解除される．したがって，リボソームの停滞と，その結果起こるSecAの合成は，細胞の分泌能が不足した条件下でより長時間持続する．このように，SecMは新生鎖の状態で，分泌活性モニターという生理機能を発揮する．

SecMはエンテロバクター目とパスツーレラ目に保存されているが^6），その他の細菌種がSecAの発現を制御する機能性新生鎖を保持しているかはこの20年間不明であった．一方，異なるタンパク質局在化装置をモニターする機能性新生鎖として，枯草菌からMifMが，海洋性ビブリオ菌からVemPがそれぞれ見つかった^{7, 8）}．MifMは，タンパク質膜組込み装置であるYidCの活性をモニターし，そのバックアップホモログの発現をフィードバック制御する^7）．VemPは，環境中のナトリウム塩濃度に応答して，分泌の駆動因子であるSecDFのホモログの発現を制御する^8）．これらの発見は，多様な細菌が同様の機能性新生鎖を細胞内環境センサーとして活用している可能性を示していた．ただし，重要なことに，機能性新生鎖の最たる特徴であるアレスト配列は，それぞれでまったく異なっていた（図1c）．また，どの因子も，近縁の細菌種からはホモログが見つかるものの，系統的に離れた細菌からは見つからない．では，はたして，本当にそれらは機能性新生鎖を持っていないのだろうか．

アレスト配列は，因子内／因子間での配列類似性が低いため，機能性新生鎖を戦略的に探索する上では，ほかの共通した特徴を考慮に入れる必要がある．SecMやMifM, VemPに共通の特徴として，①SecやYidCなどのタンパク質局在化装置因子の遺伝子の上流ORF（open reading frame）にコードされていること，②短いORFであること，③N末端に局在化シグナルを持っていること，④アレスト配列のあるC末端付近は近縁配列間で配列相同性が高いこと，などがあげられる．このような特徴を持つものを，400種ほどの細菌ゲノムから探索した結果，放線菌のApcA, ApdA，および，根粒菌のApdPが同定された^9）．興味深いことに，これらの因子が持つアレスト配列のC末端には，RAPP（アルギニン–アラニン–プロリン–プロリン）やRAPGという配列が含まれていた（図1c）．あらためてSecMの配列をみると，RAGPという類似のモチーフがある．すなわち，独立に進化してきたと思われる機能性新生鎖に意外な共通性がみえてきたのである．

機能性新生鎖の多様性やその根底に潜む共通原理をさらに理解するためには，機能性新生鎖のより包括的な同定と解析が必要である．シーケンシング技術やビッグデータ解析手法の進歩，さらには，細菌の系統的・分類学的情報を包括的に整理したGenome Taxonomy Database（GTDB）^10）の整備のおかげで，現在では，細菌ゲノム配列の大規模かつ系統的な解析が可能となっている．そこで，このデータベースに登録された代表的細菌種約3万種を対象として，機能性新生鎖の存在を網羅的かつ大規模に探索した．

この解析により，SecAとSecDF, YidCの活性をモニターすると考えられる機能性新生鎖を新たに16種類見いだすことができた（図2）．これらの因子を持つ種を細菌の系統樹にマッピングすると，分布はまばらでありながら多様な門（プロテオバクテリア，バクテロイデス，ファーミキューテスなど）にわたって機能性新生鎖が存在することが示された．したがって，機能性新生鎖の獲得は，さまざまな生息環境において，選択優位性をもたらすのかもしれない．また，アレストモチーフとN末端の局在化シグナルを除く大部分の配列の類似性がきわめて低かったことから，各因子は独立に進化してきたと考えている．一方で，シアノバクテリア門のように，まだ機能性新生鎖が見つかっていない門もある．

図2 タンパク質局在化装置をモニターする機能性新生鎖の系統的分布

secA，secDF，yidCそれぞれの上流から機能性新生鎖が見つかった細菌について，GTDB代表細菌の系統樹の周囲に彩色した（文献1より改変）．

今回見いだされた16種類の機能性新生鎖のうち，RAPP様配列を持つものは11種類見つかった．また，それらはいずれも，アレスト機能において必須であった．そのため，RAPP様配列は，多様な細菌において，翻訳アレストを起こす普遍的な要因となる可能性が考えられる．その一方で，まったくユニークなモチーフを持つものも，現時点で未発表のものも含めて複数見つかっている．配列の出現のしやすさや進化的制約／選択圧が機能性新生鎖のアレスト配列に反映されていると考えられ，興味深い．

では，RAPPモチーフを持つアレスト配列は，どのようなメカニズムで翻訳アレストを起こすのか．ドイツのMoriciらが，ApdAで停止した枯草菌リボソームおよびApdPで停止した大腸菌リボソームのcryo-EM構造を決定した^2）．

ApdAとApdPはどちらも，RAPPモチーフのRAPまでが新生鎖に取り込まれていることが生化学的に示されていたが，得られた構造モデルでは，そのどちらもRAPがほぼ同じ立体配座をとっていた（図3a）．また，ApdPのArg131やApdAのArg120は，PTC近傍にあるポケットに収まっており，ここで23S rRNAのΨ2504, G2061, G2505（いずれも大腸菌における残基番号）と直接的に，またG2505, m²A2503, G2061と水分子を介した形で，非常に安定した相互作用を形成していることが示された（図3b，青丸）．アルギニン残基の重要性は，遺伝学的にも示されている^9）．

図3 RAPP様モチーフによる一時停止のメカニズム

（a）SecMで停止した大腸菌リボソームの全体像（PDB：8qoa）およびPTC付近の拡大図．拡大図では，SecMのRAGPモチーフにApdA（PDB：8qcq），ApdP（8qbt）のRAPPモチーフを重ね合わせている．RAGPおよびRAPPモチーフがPTC付近において類似のコンホメーションをとり一時停止を起こしている．（b）SecMによる翻訳アレスト機構のモデル図（文献2, 3より改変）．ApdAおよびApdPでは図中のグリシン（Gly）がプロリンに置き換わる．

では，実際にどのようなメカニズムで翻訳が阻害されているのか．通常のペプチド基転移反応においては，AサイトのアミノアシルtRNAのα-アミノ基が，PサイトのペプチジルtRNAのカルボニル炭素に求核攻撃する（図3b，赤矢印）．しかし，構造解析の結果，求核攻撃が起きづらい状態で安定化していることが明らかになった（図3b）．これは，ApdAやApdPで停止した構造において，PサイトのRAPモチーフのアラニンのカルボニル酸素が，AサイトのプロリルtRNAのN–Hと，非典型的な水素結合を形成していたことによる（図3b，青破線）．これにより，求核攻撃においてAサイトのプロリルtRNAから抜けるべきプロトンの移動が妨げられており，求核攻撃が損なわれ，結果的にペプチド結合形成が阻害されると考えられる．分子動力学シミュレーションの結果もこの可能性を支持していた．RAPモチーフを介した翻訳アレストが細菌全般に通じる普遍的な機構である可能性は考えられる．特にRAPモチーフが相互作用するPTCのrRNA残基は種を超えて高度に保存されている．実際に，RAPP様配列を持つ因子は我々の探索で多様な細菌門から見つかった^1）．ただし，重要な点として，ApdAは枯草菌リボソームを停止させるが大腸菌リボソームは停止させない^9）．一方でApdPは大腸菌と枯草菌のリボソームを停止させる．この理由は構造解析からは解明できなかった．我々のApdA-ApdP部分的スワッピング解析により，RAPPモチーフのすぐ上流（N末端側）に位置する5残基が，翻訳アレストが起こるかどうかの“種特異性”に大きく影響することが示唆された．つまり，ApdAの該当5残基をApdPのものに置換すると，大腸菌リボソームも停止した．それらの5残基がリボソームと相互作用しうるリボソーム側の要素について，大腸菌と枯草菌リボソームで異なる点は見つからなかったが，よりN末端側の新生鎖配列のトンネル内での構造や，リボソームとの相互作用様式の違いによって，翻訳アレストの効率や種特異性が変わってくるのかもしれない．この点については今後のさらなる検証が必要である．

さらに，同グループのGersteuerらはSecMで停止した大腸菌リボソームの構造もあらためて解析した^3）．SecMのアレスト配列は，翻訳制御機構の解明，高分解能リボソーム構造解析，コトランスレーショナルフォールディングの解析，人工的な翻訳停止ツールとしての利用など，これまで幅広い領域で利用されており，アレスト機構の正しい理解は非常に重要である．SecMの構造論文は他グループのものも併せてこれまでに3報あったが，Gersteuerらは，過去の構造モデルには再考の余地があるとし，SecMの全長を大腸菌リボソームに合成させ，その立体構造をあらためてcryo-EMで決定した．驚くべきことにSecMも，ApdA/ApdPと類似のコンホメーションをとり（図3a），同様のメカニズムで翻訳アレストを起こしていることが示唆された．すなわち，SecMのRAGモチーフが，リボソームのrRNAやAサイトのプロリルtRNAと複数の相互作用を形成し，求核反応に必要な配座変化やプロトン移動を妨げると考えられる．

翻訳アレストの「解除機構」は，機能性新生鎖の環境センサーとしての機能に重要である．たとえば，SecMであれば，N末端側のシグナル配列がタンパク質分泌装置に引っぱられることで解除されるため，その活性をモニターできる（図1）．興味深いことに，この翻訳アレストの解除は，タンパク質のフォールディングや光ピンセットによるけん引でも起こる^{11, 12）}．MifMについても，多様な引っぱり力に感受性であることが示されている^13）．すなわち，機能性新生鎖は，原理的には，新生鎖の多様な動きをモニターすることができる．近年，細胞内外で銅イオンをモニターする機能性新生鎖が報告されている^{14, 15）}．これらについては，残念ながら翻訳アレストを起こすことが実証されていないが，銅イオンが新生鎖の挙動に影響を与え．それが翻訳アレストを解除するというモデルが提唱されている．もしかしたら機能性新生鎖はこれまで知られているよりもはるかに多様な環境センサーとして，実際には用いられているのかもしれない．また，トリプトファンのようなアミノ酸，エリスロマイシンやクロラムフェニコールなどの抗生物質に依存して翻訳アレストを起こし，下流遺伝子の発現を制御する機能性新生鎖もある^{4, 5）}．機能性新生鎖はアーキアではまだ見つかっていないものの，真核生物においてはいくつか見つかっている^4）．生命のゲノム配列には，機能性新生鎖に関するいまだ隠された秘密が潜んでおり，それを読み解くことで，機能性新生鎖の普遍性や多様性がさらにみえてくるかもしれない．