生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

サイクリックAMP（cyclic AMP：cAMP）は細胞内シグナル伝達の普遍的な分子として知られている．cAMPはアデニル酸シクラーゼ（AC）によってATPから合成され，cAMPホスホジエステラーゼ（PDE）によってAMPに加水分解され，シグナル分子としての活性を失う．ACおよびPDEはcAMPの細胞内濃度調節を通して，原核生物から真核生物まで多様な生物において数多くの重要な細胞機能を担っている^1–4）．AC, PDEは多くの生物において重要な役割を果たしているため，植物においてもAC, PDEを単離することに多大な努力が払われてきた．しかし，被子植物からは真核生物が共通して持っているクラスIII ACやクラスI PDEと相同性のある配列が見つからず，また，細胞内cAMPレベルが低いことからcAMPの生物的機能については長い間議論されてきた^4–6）．その中で，筆者らはコケ植物ゼニゴケ（Marchantia polymorpha：Mp）からN末端側にクラスI PDE，C末端側にクラスIII ACドメインを持つタンパク質をコードする遺伝子を同定し，Combined AC with PDE（CAPE）と命名した^7）．本稿では，CAPEの生化学的特徴と機能について紹介する．

植物研究は，その農業や陸上生態系における重要性から，主に被子植物を対象に進められており，cAMPシグナル伝達に関する研究も例外ではない．動物におけるcAMPシグナル伝達機構の研究が発展するのと並行して，被子植物においても，動物で効果のある薬剤やcAMPを植物に投与して生理反応を調べる研究や，生化学的手法を用いて，AC活性，PDE活性およびcAMP依存的リン酸化活性を検出する研究が行われ，cAMPシグナルに関する理解が進んできた^8）．2000年に解読されたシロイヌナズナのゲノムからは，ACやPDE，プロテインキナーゼA（PKA）の遺伝子は見つからず，被子植物に特有のcAMPシグナル伝達機構が存在すると考えられた．その後の研究により，現在までに10を超えるAC遺伝子が単離されており，最近では，オーキシン受容体TIR1およびそのホモログがAC活性を持つことが報告されている^9）．繰り返しになるが，これらのタンパク質は動物のACとの相同性を持たない．一方，近年の大規模な塩基配列解析の進展は，被子植物を含む陸上植物の主要系統の進化的分岐に関与する分類群のゲノムおよびトランスクリプトーム情報の蓄積を加速させ，これにより，植物の多様化や新規形質の進化が，遺伝子レベルの変化と関連づけて体系的に理解されつつある．その中でも，苔（タイ）類のコケ植物であるゼニゴケは，精密なゲノム解析と遺伝子組換え系の整備により，植物進化研究において重要な知見をもたらしている．

我々は，ゼニゴケのゲノムから，クラスIII AC遺伝子を発見した^7）．クラスIIIのACは動物や原生生物，さらには細菌に至るまであらゆる生物種に共通して存在するが，クラスI, II, IV～VIのACは原核生物にしか存在しない．このゼニゴケから見つかった遺伝子は被子植物には存在せず，植物から見いだされた初のクラスIII AC相同遺伝子である．さらに驚くべきことに，この遺伝子はPDEもコードしている．このPDEは，クラスI PDEと高い相同性を示し，これも植物において初めて見いだされたPDE相同遺伝子である^7）．クラスI PDEは真核生物に広く存在し，動物のすべてのPDEはこのクラスに属する．また，クラスII PDEは主に菌類や細菌から，クラスIII PDEは主に原核生物から見つかっている．動物では，ACとPDEはそれぞれ別の遺伝子としてコードされ，独立したタンパク質として機能するのに対し，ゼニゴケではこれらが一つのタンパク質に統合されており，きわめてユニークな特徴を持つ．これまでに発見されたACの中で，PDEと同じタンパク質として存在する例はなく，この構造的特徴に基づき，我々はこのタンパク質をCAPEと名づけた．CAPEは，N末端側にPDE, C末端側にACを持ち，ゼニゴケでは1610アミノ酸からなるタンパク質であり，推定分子量は179,000である（図1A）．さらに，PDEとACの間には2か所の推定膜貫通領域が存在するため，CAPEは膜タンパク質であり，PDEとACは膜に対して同じ側の空間に局在していると考えられる．後述するほかの植物種のCAPEにおいても，ドメイン構造と推定膜貫通領域の位置および数から，同様の局在をとると予想している^10）．ただし，CAPEがどの膜に局在しているかについては，現時点では明らかになっていない．さて，ACとPDEを両方のドメインを持つことには，どのような意義があるのだろうか．cAMPを作るのか，壊すのか，どっち？という話である．近年の研究により，cAMPが細胞内を自由に拡散するのを防ぎ，cAMPが空間的に制限された領域に蓄積することで，特定のcAMPエフェクターにシグナルを伝達する機構が明らかになってきている^11–13）．この局所的なcAMP制御空間は，ACの近傍にPDEが局在し，合成されたcAMPを直ちに分解して拡散を抑制することで構築される^11–13）．CAPEはACとPDEの両ドメインを持つことで一つの分子内でcAMPの合成と分解を制御し，個々のCAPEが独自にcAMP制御空間を形成している可能性がある．ゼニゴケにおいてこのような機構が存在するのか，存在するのであれば，どのような役割を果たしているかは，今後の研究によって明らかにされるべき課題である．

図1 二機能性タンパク質CAPEの構造と機能

（A）CAPEの構造的特徴と反応模式図．ACドメインはATPを基質にcAMPを合成する反応を触媒し，PDEドメインは作られたcAMPを加水分解する反応を触媒する．（B）ゼニゴケ精子のかたちと遊泳軌跡．ゼニゴケ精子は2本の鞭毛を持つ．野生株精子は直線的に泳ぐが，Mpcape機能欠損株精子は直線的に泳げない．

1）ACドメインの特性

大腸菌においてcAMPはグルコース欠乏のシグナルとしてカタボライト抑制の解除に関与していることから，大腸菌AC遺伝子欠損株に遺伝子を導入して糖（マルトースなどグルコース以外のもの）の資化能を調べることで，導入遺伝子によるcAMP生成活性の評価が可能である．この手法を用いて大腸菌のAC遺伝子欠損株にゼニゴケCAPEのACドメインを導入することで，糖の資化能が回復することが確認された．さらに，ACドメインの発現によりcAMPの蓄積も認められた．また，大腸菌で発現・精製したACドメインの組換えタンパク質を用いた活性測定の結果，ゼニゴケCAPE-ACはクラスIII ACに共通するMn^2＋依存的な活性化を示した．これらの結果から，配列の保存性だけでなく，機能的にもクラスIII ACとしての特性を有することが明らかとなった^7）．さらに，この酵素はcGMPを産生しないことも確認された．動物のACには，膜貫通型ACと水溶性ACが存在するが，ゼニゴケCAPE-ACは水溶性ACの特徴である重炭酸イオンによる活性化は示さなかった．また，酵素の比活性が低いことが確認された．一般的に，ACは何らかの機構によって活性化される．現在観察されているCAPE-ACの低い比活性は，CAPE-ACも何らかの活性化機構を有する可能性を示唆している．今後の研究では，この活性化機構の解明が重要な課題となる．

2）PDEドメインの特性

ゼニゴケCAPEのPDEドメインを大腸菌で発現，精製した組換えタンパク質を用いてcAMP分解活性を測定した．その結果，PDE活性には二価金属イオンが必須であり，生理的に働いていると考えられるMg^2＋と比較してCa^2＋存在下で3.5倍の活性を示し，調べた中で最も高い活性を示した^14）．このことから，Ca^2＋シグナル伝達系と相互作用する可能性が示唆される．また，cGMPに対する分解活性はきわめて低く，本酵素はcAMP特異的である^7）．ヒトのクラスI PDEは，触媒ドメイン以外の構造から11種類のファミリーに分類され，それぞれが異なる生理機能を持つことから，PDEをターゲットとする阻害剤がさまざまな疾病の治療薬として開発されている．ゼニゴケCAPE-PDEに対する阻害剤の感受性を調べた結果，広範なPDEファミリーに作用する非選択的阻害剤であるIBMXやテオフィリン，さらにゼニゴケCAPE-PDEと系統的に最も近縁なPDE9ファミリーの選択的阻害剤は，いずれも阻害効果を示さなかった．唯一，非選択的PDE阻害剤であるジピリダモールが高濃度で部分的に阻害を示した^14）．これらの結果から，ゼニゴケCAPE-PDEは動物PDEとは構造的に異なる特性を持つ可能性が示唆される．

ゼニゴケにおけるCAPEの生理機能を予測するため，CAPEプロモーターの下流にGUS（β-グルクロニダーゼ）遺伝子を導入した株のGUS染色により，CAPEプロモーターの活性部位を解析した．ゼニゴケは雌雄異株の植物であるが，CAPEプロモーター活性は特に，雄株の精子を造る器官である造精器の成熟に伴って上昇していくことがわかった^15）．この結果から，CAPEは精子の形成や機能に関与することが示唆された．そこでCRISPR/Cas9法を用いてCAPE-ACドメインをターゲットにCAPE機能欠損株を作出し，表現型の解析を行った．Mpcape機能欠損株の精子は野生株同様に，一つの細胞体と2本の鞭毛を持って形成された．精子懸濁液のcAMPレベルは野生株とMpcape機能欠損株で同程度であった．興味深いことに，ゼニゴケ精子懸濁液から測定されたcAMPレベルは動物精子と同等であり，また，雄の生殖器托である雄器托から検出されたcAMPレベルはこれまで報告されていた植物におけるcAMPレベルより2桁高かった^15）．

精子の形態に異常はみられなかったが，雌の野生株と雄のMpcape機能欠損株を交配させたところ胞子体を形成できないことがわかった^15）．胞子体が形成できないのは卵にたどり着けなかったためか，それとも，卵にはたどり着けるが，その後の発生がうまくいかないためかを調査したところ，Mpcape機能欠損株精子は卵にたどりつけないことが明らかになった．そこで精子の運動を観察してみると，野生株精子は直線的に泳ぐのに対し，Mpcape機能欠損株精子はその場で小さく回転運動するものや，しびれたように動き移動しないものがほとんどであった（図1B）．精子の鞭毛運動に着目すると，野生株に比べて振幅が小さく，鞭毛波形にも異常がみられた．さらに，MpCAPE遺伝子を入れ戻した相補株ではこれらの精子の運動性が回復したことから，ゼニゴケにおいてCAPEは精子の鞭毛運動に関与し，このCAPEを介した鞭毛運動の調節は受精にも重要な役割を果たしていることが明らかになった^15）．

我々のグループはこれらに加えて，これまで被子植物には見つかっていなかったcAMPの下流因子であるPKAがゼニゴケゲノム上にあることを発見した．PKAの調節サブユニットを相同組換えでノックアウトしたMppka調節サブユニット欠損株の精子はMpcape機能欠損株同様に精子の運動性が低下することを明らかにした^15）．以上より，ゼニゴケにおいてCAPEおよびPKAというcAMPシグナル伝達モジュールが精子の運動調節機構に重要な役割を果たしていることが明らかになった．

これまでの結果からCAPEはゼニゴケ精子の運動性に関与することが明らかになった．ここで緑色植物においてCAPEがどの分類群において保存されているのかについてまとめる（図2）．緑色植物は緑藻とストレプト植物に大別され，ストレプト植物の有性生殖様式は三つに分類される．運動性のない精細胞を花粉管の伸長により卵細胞まで送達する様式，運動性精子（精子）が泳ぐことで卵細胞まで到達する様式，もう一つは接合である．緑色植物の各分類群において，ゲノムとトランスクリプトーム情報を用いたデータベース検索，およびcDNAの単離からCAPEの系統分布を調査した．その結果，陸上植物の中でも精子を造る，ソテツ，イチョウ，シダ植物，小葉植物，コケ植物にはCAPEが保存されていた．ストレプト藻類の中でも，精子を造るコレオケーテやシャジクモ（車軸藻）にはCAPEがあるが，精子を造らないクレブソルミディウムや接合藻類にはCAPEがないことがわかった．つまり，花粉管の伸長や接合により有性生殖する植物ではCAPEは失われており，精子を用いた生殖様式の喪失とCAPE遺伝子の喪失がほぼ一致する．実際，精子を介して繁殖するストレプト植物はCAPE遺伝子を保持している^10）．このことから，ストレプト植物においてCAPEは精子運動機能に関与し，有性生殖様式の変遷と強く関連する因子であると考えられる．一方例外として，スギやヒノキなど，ヒノキ科の裸子植物にCAPEが存在している．これらの分類群は精子を形成しないため，精子運動とは異なるゼニゴケで未確認のCAPEの機能がこの分類群に残されている可能性がある．

図2 緑色植物におけるCAPEの系統分布

運動性精子（精子）はストレプト植物進化の過程で独立して3回失われている．精子を造るストレプト植物はCAPEを持つ．丸はストレプト植物における，精子の獲得を，三角は精子の喪失を，四角はCAPEの喪失を意味する．

我々は以上のようにゼニゴケにおいて，cAMP合成と分解をつかさどるCAPEを発見し，CAPEがcAMPシグナル伝達機構を介して精子の運動調節に関与すること，また，CAPEが精子を介して有性生殖するストレプト植物に高度に保存されていることを明らかにしてきた．さらに，哺乳類においてcAMPの主要なターゲットとして知られるPKAがゼニゴケにおいてCAPE同様，精子の運動性に寄与していることを明らかにした．哺乳類精子では受精能獲得，運動性，先体反応にcAMPシグナル伝達が必須であることが知られている．鞭毛の構造や鞭毛運動の関連因子は真核生物で普遍的に保存されているため，ゼニゴケ精子を用いた研究は植物だけでなく哺乳類など，鞭毛を有する真核生物全般への理解につながる可能性がある．今後は，CAPEの細胞内局在や，ゼニゴケ精子における局所的なcAMP量の調節機構，さらにはcAMPシグナルを受容する下流因子の解明を通じて，動植物での共通性と相違点がみえてくるだろう．