生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

ヘモグロビンは血液中の赤血球に多く含まれており，肺で取り込んだ酸素を末梢組織で放出し供給するという酸素運搬を担うタンパク質である．α, βの2種類のサブユニットがそれぞれ2分子ずつ会合した四量体構造をとり，各サブユニットには1分子の鉄イオン錯体のヘムが配位しており，そこに酸素が1分子結合する．ヘモグロビンの機能と立体構造は数億年も前から脊椎動物の間で保存されている．酸素分圧の高い肺では，酸素が結合したR（Relaxed）型構造をとり，一方で酸素分圧の低い末梢組織などでは酸素が解離した酸素親和性の低いT（Tense）型構造をとる．この四量体間の立体構造変化は，ほとんどすべての脊椎動物に共通して有機リン酸によるアロステリック制御を受ける．これらのアロステリック因子は，酸素とは異なる部位に結合することで酸素親和性を低下させる．ヒトなど哺乳類では2,3-diphosphoglycerate，鳥類ではinositol pentaphosphate，爬虫類の多くではATPといった赤血球中に多く存在する代謝産物がアロステリック因子として働く^1）．魚類や一部の潜水する哺乳類や鳥類（アザラシやペンギンなど）は有機リン酸に加えてpHによるアロステリック制御が報告されている^2）．それに対し，脊椎動物で唯一，ワニのヘモグロビン（以下ワニHb）は有機リン酸への親和性は示さず，HCO₃⁻（重炭酸イオン）によるアロステリック制御を受ける．ワニが息を止めて潜水すると，血中の二酸化炭素濃度が上昇し，水和物であるHCO₃⁻が生成され，ヘモグロビンに結合して酸素の解離を促進する．ワニはこの仕組みを利用し全身へと酸素を供給することができる^{3, 4）}．たとえば，ヒトでは取り込んだ酸素の半分ほどしか全身に供給できないのに対し^5），ワニはほぼすべての酸素を使い切ることができる^6）．ワニは長時間潜水して獲物を待ち伏せし，捕らえた獲物を水底に引きずり込んで溺死させてから捕食するという生態を持っている．進化の過程でワニのみが獲得した，ヘモグロビンの独特なアロステリック制御の仕組みにより，特徴的な狩りの手法をとることが可能になった一因と考えられている．

ワニHb特有のHCO₃⁻作用が解明されて以降，多くの研究者がこれに注目した．1995年に長井潔教授らのグループによって，ワニ特有の12残基（α, βサブユニットにそれぞれ7残基と5残基）のアミノ酸置換を施したヒトのヘモグロビン（以下ヒトHb）改変体（Hb Scuba）がワニHbと同様のHCO₃⁻作用を示すことが示された^7）．これらの実験をもとにβサブユニットの連続する三つの正電荷アミノ酸残基（Lys β38-Arg β39-Arg β40）がHCO₃⁻との結合に関与することが推定された．しかし，ワニHbのHCO₃⁻作用が報告されて^3）から40年以上が経過したが，いまだに立体構造は報告されておらず，HCO₃⁻作用によるアロステリック制御のメカニズムが解明されていなかった^8）．ヘモグロビンはX線結晶構造解析により立体構造が初めて決定されたタンパク質の一つであるが，天然のワニHbは結晶化が困難であったことから，Max Perutz博士をはじめ，テイム研究室でも結晶化は試みられてきたが，結晶構造解析には成功しなかった．そこで，我々は結晶化の必要がないクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）単粒子解析法を用いることにより，初めて天然のワニHbの酸素／一酸化炭素結合状態のR型構造と，脱酸素（デオキシ）状態のT型構造の決定に成功した．本稿では，ワニHb特有のHCO₃⁻作用について生理学的機能，分子進化も交えて，その機序を紹介する．

North Texas大学にて研究目的で飼育されているワニ（アメリカアリゲーター，Alligator mississippiensis）の採血から精製されたワニHb試料を用いた．ワニHbは一酸化炭素（CO）が結合した安定な状態で凍結され，日本へ空輸された．COを励起・解離するために，白熱灯を照らしながらCO結合型ワニHbを酸素ガスにさらして気体分子の交換を行い酸素結合型ワニHb試料を調製した．また，他の脊椎動物のHbにはほとんどないが，ワニHbは分子表面にシステイン残基が多いことから，還元剤として10 mMの高濃度のジチオスレイトールを添加した結果，凝集が抑えられ粒子が分散した良質な電子顕微鏡（以下電顕）像を得ることができた（図1a）．粒子像からヘモグロビンの四量体構造が観察できている（図1a右上）．デオキシ型観察試料については，大阪大学蛋白質研究所栗栖研究室の，嫌気チャンバー内に設置された試料凍結装置（Vitrobot）を使用して調製した（図1b）．酸素結合型ワニHbに亜ジチオン酸を添加して酸素をヘムから取り除き，重炭酸塩を添加した状態で速やかに観察試料を凍結した．ちなみに，当初は空気中でデオキシ型試料の調製を試みたが，観察試料を凍結する数秒の間に酸素が結合してしまい，目的のデオキシ状態のT型構造を得られなかった．あらためてヘモグロビンの酸素親和性の高さには驚かされた．

図1 試料調製とクライオ電子顕微鏡解析

（a） CO結合型ワニHbの電顕像とHb粒子の拡大像．（b）デオキシ型電顕観察試料を作製した嫌気チャンバー内の試料凍結装置（画像提供：大阪大学蛋白質研究所，栗栖源嗣教授，川本晃大助教）．

CO結合型，酸素結合型ワニHbのどちらも，2.3 Åの分解能の電子顕微鏡密度マップを得て構造を決定した（CO結合型PDB：8wix，酸素結合型PDB：8wiy）（図2a）．どちらの構造も，cryo-EMでの構造決定が難しいとされているヘモグロビンのような小さな分子量のタンパク質の中でも高分解能であり，COや酸素のような小さな分子をモデリングするのに十分に強い密度が観察された（図2b）．他の研究では，市販されている乾燥凍結ヒトHbを用いてcryo-EM構造が報告されているが^9），本研究では安定な状態で調製した天然のワニHbを用いたことが高分解能での構造決定に大いに貢献したといえる．

図2 ワニHbの立体構造とアミノ酸置換

（a） CO結合型ワニHbの電子顕微鏡密度マップ．αサブユニットを白色，βサブユニットを灰色，ヘムを赤色で示している．（b） αサブユニットのヘム周辺の密度マップと分子モデル．αサブユニット，ヘム，一酸化炭素（CO）の炭素をそれぞれ，白色，赤色，黄色で示している．（c）デオキシ型ワニHbの電子顕微鏡密度マップ．（d） HCO₃⁻周辺の密度マップと分子モデル．βサブユニット，HCO₃⁻の炭素をそれぞれ，灰色，黄色で示している．ワニ特有のアミノ酸に*をつけている．（e） HCO₃⁻との結合様式．βサブユニット，HCO₃⁻の炭素をそれぞれ，灰色，黄色で，結合を水色で示している．（f）（e）と同じ角度から見たデオキシ型ヒトHb. （g）ワニと鳥類の進化系統樹および進化の過程で起きたアミノ酸置換の概要図．文献11より改変して引用．

デオキシ型ワニHbも2.2 Åの分解能の電子顕微鏡密度マップを得て構造を決定した（PDB：8wiz）（図2c）．ヘムの湾曲や，ヘムと近位ヒスチジン残基（His α58, His β63）に結合した水分子が結晶構造同様にみられた．本研究における最も重要な発見は，T型構造をとったデオキシ状態のワニHbの構造において，αβサブユニット二量体間界面の対称位置2か所にHCO₃⁻の密度が観察されたことである（図2d）．ヘモグロビン1分子に対してHCO₃⁻が2分子結合する様式自体は，過去の生理学実験で示された結果と合致している^{4, 10）}．先行研究^{7, 11）}で予測されていた結合位置に近かったが，今回の構造によって，長らく望まれていたHCO₃⁻の作用様式に関して初めて具体的な議論ができるようになった．正電荷アミノ酸（Lys β38）とHCO₃⁻の負電荷の間のイオン結合に加えて，HCO₃⁻は極性アミノ酸（Tyr α42, Trp β37, Arg β40, Tyr β41, Asn β102）の側鎖と複雑な水素結合を形成していた．

興味深いことに，今回明らかになったワニHbのHCO₃⁻の結合位置は，他の脊椎動物のHbにおけるアロステリック因子である有機リン酸の結合位置と異なる．2,3-diphosphoglycerateが結合したデオキシ型ヒトHbの結晶構造^12）が1972年に報告されたが，当時はProtein Data Bank（PDB）が整備された直後だったため，座標ファイルが登録されていない．そのため，現状，有機リン酸が結合したヘモグロビンの座標ファイルと比較することができないが，有機リン酸は二つのβサブユニット間の対称軸上に正電荷アミノ酸と相互作用して1分子結合することが知られている．また，他の脊椎動物では高度に保存されている有機リン酸の結合に関わる正電荷アミノ酸（His β2, His β143）が，ワニHbではどちらもアラニンに置き換わっており，リン酸に対する親和性の低下につながっていることが示唆された．

では，HCO₃⁻の結合位置はどう特徴的なのだろうか．前述のとおり，他の脊椎動物にはみられない新規の位置にワニHbではHCO₃⁻が結合し，αβサブユニット二量体間界面の正電荷アミノ酸や極性アミノ酸に包囲されていた．その中でも，Lys β38とTyr β41はワニにのみみられるアミノ酸置換であり，この2残基がHCO₃⁻との結合に特に重要であることがわかった．βサブユニットの38番目のアミノ酸残基は，ヒトなど哺乳類や，ワニの近縁種である鳥類の多くではではトレオニンとなっているが，ワニでは側鎖が長く，正電荷を持ったリシンに置き換わっていることでHCO₃⁻と結合することが可能になっている（図2e, f）．また，βサブユニットの41番目のアミノ酸残基はフェニルアラニンであることが多いが，ワニでは側鎖の先端に水酸基を持つチロシンに置き換わっていることでHCO₃⁻と水素結合の形成が可能になっている（図2e, f）．

先行研究^7）でHCO₃⁻との結合に関わると推測されていたβサブユニットの連続する三つの正電荷アミノ酸残基のうち，Lys β38とArg β40は推測どおり結合に関わっていたが，もう一つのArg β39は予想外なことに，HCO₃⁻とは反対側を向いてT型構造をとったβサブユニットの構造を安定化していることがわかった．他の多くのワニ特有のアミノ酸置換であるSer→Ala α35, Phe→Tyr α36, Leu→Phe α100, Thr→Lys β38や，Ala→Arg β135も同様にT型構造においてサブユニット間相互作用を形成し，構造を安定化している．Leu→Met β31のアミノ酸置換はHCO₃⁻と結合するLys β38の反対側の空いた空間を埋めて支えている．このようにワニHbでは，酸素親和性の低いT型構造を安定化して，酸素を放出しやすくする仕組みを進化の過程で獲得してきたことが明らかになった．

今回cryo-EMを使用してあらゆる状態のヘモグロビンの構造解析をしたことで，四量体の構造変化に関しても新たな発見が得られた．デオキシ状態のワニHbのT型構造については，T型のヒトHb結晶構造（PDB：2dn2^13））とアミノ酸Cα位置のRMSD（Root Mean Square Deviation，平均二乗偏差）が1 Å未満と，非常に似た構造をとっていた．

一方で，酸素またはCOが結合した状態のR型構造では，ヒトHbとワニHbで大きく異なる構造をとっていた．ヘモグロビンのR型四量体構造はこれまでに一般的な酸素結合型構造とされる「R型」に加えて，低塩濃度条件下で得られる「R2型」^14）の，主に2種類の結晶構造が報告されており，二つのαβサブユニット二量体の相対的な回転角が異なる．R型（PDB：2dn3）の回転角は約15度であるのに対し，R2型（PDB：1bbb）は約23度と「より開いた」分子構造をしている．今回cryo-EMを用いて構造決定したヒトHbのCO，酸素結合型構造（PDB：8wj0, PDB：8wj1）は回転角が約22度とR2型構造と近かった一方で，ワニHbのCO，酸素結合型構造（PDB：8wix, PDB：8wiy）は回転角が約16度とR型構造と近かった（図3a～f）．

図3 ヘモグロビン二量体間の回転角の比較

（a～f）灰色で示したデオキシ型ヒトHb結晶構造（PDB：2dn2）を基準にしたαβサブユニット二量体間の回転角．（a）デオキシ型ワニHb電顕構造（PDB：8wiz）を橙色，（b）酸素結合型ワニHb電顕構造（PDB：8wiy）を赤色，（c） R型ヒトHb結晶構造（PDB：2dn3）を緑色，（d） CO結合型ワニHb電顕構造（PDB：8wix）を青色，（e） CO結合型ヒトHb電顕構造（PDB：8wj0）を紫色，（f） R2型ヒトHb結晶構造（PDB：1bbb）を白色で示している．

結晶構造解析では，結晶化パッキングの影響を受けることに加えて，非生理的な塩濃度やグリセロールなどの粘性を持つ抗凍結剤を含む環境で結晶化実験を行う．一方で，cryo-EMによる単粒子構造解析では，非晶質な氷に埋もれたタンパク質分子を観察していることから，より生理的環境下でのヘモグロビンの分子構造を反映していると考えられる．今回，生体から採取した天然のヘモグロビン試料を用いて得られた構造が，ヘモグロビンの生体中での実際の構造変化についての長年の議論^15）に対する答えにつながると期待される．

本研究によって明らかになったワニヘモグロビンの立体構造より，ヘモグロビンの分子進化がワニの生物進化に関連性があったことがうかがえる．これまでの分子進化の研究から，ワニと鳥類の共通祖先からワニが進化した後，HCO₃⁻と直接的に結合するアミノ酸置換とリン酸との結合に関わるアミノ酸置換が起こったと考えられている（図2g）^11）．それだけでなく，直接的にHCO₃⁻結合に関わるアミノ酸のほかにも，T型構造を安定化するアミノ酸置換が分子内のあらゆる箇所で起こったことが合わさって，酸素放出を促進する仕組みを獲得し，ワニの潜水能力を活かした習性に恩恵をもたらしたと考えている．

ワニHbのHCO₃⁻作用を付与したヒトHb改変体は長年医療への応用が期待されてきた．しかし，Hb Scubaでも，ワニHbと同様のHCO₃⁻作用を示し，ヒトHbよりもはるかに高い酸素親和性を示したが^7），分子の安定性の問題が最も懸念されており，実用化にはまだタンパク質工学的研究が求められる．今回の成果から，より安定な改変体を作ることができれば，将来的には，先天的に心肺機能に障害があり酸素運搬能の弱い患者への遺伝子治療や，出血を伴う手術中の患者への輸血用人工血液などへの実用化につながる可能性がある．