生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

ゴルジ体は袋状の膜構造（ゴルジ槽）が積み重なったゴルジ層板から構成されるオルガネラであり，小胞体から送られてきたタンパク質（積荷）を修飾・選別し，成熟したタンパク質を適切な場へと輸送する．ゴルジ層板は小胞体側から，シス槽・メディアル槽・トランス槽と分かれているが，その最もトランス側にはトランスゴルジ網（trans-Golgi network：TGN）が付着しており，タンパク質の選別を行う中枢を担っている．タンパク質を適切に選別してその機能部位へと輸送することは細胞機能の維持に必須であることから，選別輸送機構に関する研究はこれまでにも数多く行われている．しかし，選別がどのようにして行われているかについてはいまだ明らかになっていない．

蛍光顕微鏡システムと蛍光タグ開発の進歩により，近年では，細胞内のタンパク質の微細な動きを追跡できるようになってきた．積荷の輸送過程の観察は，ゴルジ体における選別機構を解明するために重要であるが，定常状態の細胞では輸送過程にある積荷の量が微量であり，検出することは困難である．そこで，積荷を小胞体に蓄積させた後に，同調的に輸送開始させることで，輸送過程にある積荷の量を増やし，観察可能とする輸送開始実験法が開発されてきた．温度感受性変異体やタンパク質の凝集と解離を利用した手法，近年ではretention using selective hooks（RUSH）法^1）が多くの研究者に用いられている．しかしながら，これら，既存の手法にはいくつかの課題点が存在する．本稿では，従来の輸送開始実験法が抱える課題克服のために我々が開発した新たな輸送開始実験法について，その原理から実例までを記す．

現在最も広く用いられているRUSH法では，ストレプトアビジンを小胞体に局在させるためにKDEL配列を付加し，積荷タンパク質にはSBP（streptavidin-binding peptide）を付加して，両者を共発現させる．細胞内において，ストレプトアビジンがSBPを捕捉することで，積荷も小胞体にとどめられる．その後，ビオチンを細胞に加えると，ビオチンはSBPよりもはるかに強くストレプトアビジンに結合するため，SBPとの結合が解け，積荷は小胞体から遊離する．これにより，積荷の同調的な輸送が開始され，その輸送過程の観察が可能となる．RUSH法は，さまざまな細胞種において利用されており，また，ビオチン投与により簡便に輸送開始を誘導できるとされている．しかしながら，我々はRUSH法にいくつかの課題点があることを見いだした．第一に細胞に発現している上述2種類のRUSHコンストラクトの発現量に依存して，輸送開始に遅れが生じる．第二に，ビオチンとストレプトアビジンの結合が不可逆的であるため，ビオチン投与により遊離した積荷のストレプトアビジンへの再結合は起きず，ERESからの同調的な輸送が可能な量を超えた積荷が遊離した場合，積荷は順次ERESから排出されることになる．そのため，積荷のゴルジ槽レベルでの輸送観察が難しい．第三として，輸送開始のためにはビオチン投与が必要であるため，ビオチンを多く含む細胞種や薬剤投与が困難な生物では使用することが難しい，もしくはできない．これらの課題は，輸送開始にビオチンの投与が必要であることに起因しているため，我々は光によって輸送開始を制御できる輸送開始実験法の構築を目指した．光照射による輸送開始実験法もすでに報告されているが^{2, 3）}，いずれの方法も，試薬の投与や細胞に害となるUV光の照射を必要としており，簡便かつ細胞にダメージのない方法とは言いにくい．そこで，試薬を必要とせず，比較的長波長の光で制御可能なLOVTRAP法^4）を基盤として，新規手法を開発することにした．

LOVTRAP法は2016年にWangらにより報告された，興味のあるタンパク質を光照射により供給することを可能にした方法である．彼らは植物の青色光受容体フォトトロピン1のドメインの一つであるlight-oxygen-voltage-sensing（LOV2）ドメインに暗所で強力に結合し，光照射により解離する人工タンパク質Zdark（Zdk）を作製・単離した．LOVをミトコンドリアなどに局在化させ，Zdkに興味のあるタンパク質を融合させて暗所で発現させることでミトコンドリアにトラップしておき，光を照射することで興味あるタンパク質を遊離・供給することが可能である．LOV2は400～500 nmに吸収波長を持ち，光照射によってC末端に位置するJα-helixが解ける．Wangらは3種類のZdkを報告している．そのうちZdk1はLOV2のJα-helixを包み込むように結合し，暗構造LOV2に対する結合定数は26.2 nM，明構造LOV2に対しては結合定数4 µMと，明暗構造のLOV2との結合定数の差が著しく大きい．また，明構造LOV2は時定数（t_1/2）18.5秒で自発的に暗構造へと戻るため，光照射のON/OFFを切り替えることで両者の結合を可逆的に制御できる．

我々はこのLOVTRAP法を発展させ，次のような新規輸送開始法を確立した^5）．まず，LOV2に小胞体局在化タンパク質であるヒトSec61βを融合させ，Zdk1には積荷タンパク質を融合させる．暗所では，Zdk1がLOV2に結合することで積荷は小胞体内に留まるが，光照射により，その結合が外れ，積荷が小胞体から遊離する．同調的に遊離した積荷は小胞体から解放され，その輸送過程を観察することが可能となる．我々は，暗構造LOV2を利用して積荷を保持することから，この手法をretention using dark state of LOV2（RudLOV）法と名づけた（図1A）．

図1 RudLOV法の原理

（A）RudLOV法の概略図．暗所ではLOV2のC末端側にはJα-helixが形成されており，Zdk1と強く結合する．青色光を照射するとJα-helixが解け，Zdk1との結合親和性が低下する．遊離したZdk1融合積荷は小胞体からゴルジ体へと輸送され，その輸送過程を観察できる．（B）RudLOVコンストラクトを発現させたHeLa細胞の共焦点顕微鏡画像．ノコダゾールを処理することでゴルジ層板を散在させて実験を行った．シスゴルジマーカーRb::GM130を赤，積荷NeonGreen::VSV-Gを緑，トランスゴルジマーカーGalT::iRFP713を青で示している．光照射前（pre）では細胞全体に積荷VSV-Gが局在しているが，光照射直後（10 m）には細胞全体のゴルジ層板に蓄積し，時間経過とともにシスゴルジマーカーからトランスゴルジマーカーへと移行した後ゴルジ体から搬出される．10分，25分後については，左下に拡大像を示した．積荷VSVGは10分ではシスゴルジマーカーGM130と共局在しているが（黄矢印），25分ではトランスゴルジマーカーGalT::iRFP713と共局在している（シアン矢印）．スケールバー：5 µm.

RudLOV法による輸送制御を検証するために，ヒト培養細胞HeLa細胞に小胞体局在LOV2とZdk1融合積荷を発現させ，共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察を行った．LOV2の吸収波長は400～500 nmと広く，自然光にも反応してしまう．そのため，ハンドリングの際には細胞を遮光したり，細胞観察にはフィルタを用いるなどの工夫が必要である．また，緑色蛍光タンパク質の蛍光の検出時に積荷輸送を開始してしまわないように，通常の488 nmレーザーではなく，514 nmのレーザーを用いて緑色蛍光タンパク質を励起する必要がある．輸送開始時の光照射は，我々はもっぱら共焦点レーザー顕微鏡のスキャニングにより行っているが，落射照明（LED）による輸送開始の誘導も可能である．輸送を追跡するのに十分な量を確保するため，5分から10分程度の光照射を行うが，10分程度の光照射で十分量の積荷を輸送開始させるためには，一定の光量が必要となる．装置や環境により異なるため各自簡単な条件検討をしなければならない．我々の経験からは，論文に記載した三つの積荷（TNFα, VSV-G, GPI-AP）の場合は，FV3000により0.3％レーザーパワーで細胞一つの全領域をスキャンする形で5分の照射を行うと十分量の積荷の輸送が開始する．この量の光照射では細胞に悪影響が出ることはない．輸送開始された積荷はゴルジ体に蓄積するが，輸送を開始しなかった積荷は小胞体に残る．観察時に小胞体局在積荷がノイズとなる場合は，ゴルジ体外領域をROI（region of interest）で指定し，積荷の蛍光をブリーチングするのが好ましい．哺乳類細胞ではゴルジ体は，その基本単位であるゴルジ層板が核周辺部に集まりゴルジリボンを形成して存在している．ゴルジリボンの状態ではゴルジ層板内での積荷のシス槽からトランス槽への移行を詳細に観察することは難しいため，ここでは，ノコダゾールを処理して微小管の重合を阻害し，ゴルジ層板を散在させて観察を行った．ノコダゾール処理によりゴルジ層板のシス-トランス極性や積荷輸送に遅延するなどの影響がないことはすでに報告されており^6），また我々の観察でも示されている^5）．

光照射を行うと，小胞体に局在していた積荷の一部がゴルジ体へと集積し，時間経過とともにゴルジ層板内をシス槽からトランス槽へと移行した後，ゴルジ体から消失した（図1B）．ここでは，積荷のゴルジ体への蓄積を輸送開始，ゴルジ体からの消失を輸送完了として定義づける．はじめに，RUSH法とRudLOV法の間の輸送開始同調性の違いについて検証した．RUSH法では，100 µMビオチンを投与してから10分経過した時点では発現量の低い細胞でのみ輸送が開始され，発現量の多い細胞では輸送が開始されなかった．発現量の多い細胞は30分経過後に輸送が開始されており，輸送開始に遅延がみられるとわかった．一方，RudLOV法では，10分間の光照射直後，すべての細胞で積荷のゴルジ体蓄積が観察されており，より高い同調性が認められた（図2A）．

図2 RudLOV法の輸送同調性・輸送開始限局性・輸送量の制御

（A）RUSHまたはRudLOVコンストラクトを発現させたHeLa細胞の共焦点顕微鏡画像．積荷VSV-Gの蛍光を示している．青矢印は輸送開始されていないゴルジ層板，黄矢印は輸送開始されたゴルジ層板を示す．積荷の発現量が多い細胞の場合，RUSH法では輸送開始が遅延している．一方，RudLOV法では積荷発現量の多少にかかわらずすべての細胞で同時に輸送が開始されている．スケールバー：10 µm．（B）局所的な輸送開始の様子を示したモデル図．光照射を行った領域のゴルジ層板でのみ積荷の蓄積が観察されている．（C）輸送量の調節を示したモデル図．照射停止により，LOV2は自発的に暗状態へ戻るため，レーザー強度や光照射時間を変えることによって，積荷の輸送量を制御することができる．

光を用いる際のメリットの一つはその限局性である．前述したとおり，ノコダゾールを処理した細胞ではゴルジ層板が散在するため，細胞内の一つのゴルジ層板のみに限定して光照射を行うことができる．5分間の光照射後，積荷のゴルジ層板への集積は光照射を行った層板にのみ観察され，非常に限局的かつ選択的に輸送開始を誘導できることがわかった（図2B）．この結果は，小胞体からの積荷の搬出が，積荷が遊離された領域内にあるERESから起こること，また，ERESから出た積荷はその近傍に存在するゴルジ層板へと輸送されることを意味している．

LOV2の構造変化の可逆性は，光照射量により輸送される積荷の量を制御できることを示唆している（図2C）．実際に，レーザー強度と光照射時間を変えてゴルジ体に集積した積荷の蛍光強度を測定したところ，期待どおり，レーザー強度の高さ・光照射時間の長さに応じて蛍光強度の上昇が確認された^5）．以上の結果から，RudLOV法では従来よりも精細な輸送の制御が可能となった．

RudLOV法では輸送量の制御が可能であるため，輸送される積荷量を絞ることで，ゴルジ体内部における積荷の移行を詳細に観察できる．そこで，積荷の種類による輸送経路の差異を，RudLOV法を用いて検討した．近年，エンドソームの一種であるリサイクリングエンドソーム（recycling endosome：RE）がゴルジ層板のトランス側に存在するトランスゴルジ網（TGN）と接触し，積荷GPIアンカータンパク質（GPI-AP）をTGNから直接受け取ることが明らかにされている^7）．一方，積荷TNFαはTGNからの搬出時に，TGN近傍に蓄積するもののREには局在しない．この二つの積荷の搬出過程をRudLOV法を用いて観察した．その結果，GPI-APはTGNからそこに付着しているREへと直接移行してみえるのに対して，TNFαはゴルジ体トランス槽を抜けた後，REを押し除けるようにしてTGN領域に蓄積した後，REに局在することなくTGNから搬出されることを見いだしている^5）．さらに今回，GPI-APとTGNマーカーArl1との局在を観察した．その結果，GPI-APはゴルジ体トランス槽を抜け，輸送開始後10分でTGNマーカーArl1と共局在した．その時点ではArl1区画全体にGPI-APが局在していた，輸送開始後20分経過するとArl1区画の一部領域にGPI-APが集積した．輸送開始後35分にはArl1局在部位を超えた領域に蓄積し，その後抜けていく様子が観察された（図3A）．このように，ゴルジ体トランス槽からTGNという非常に近接した膜区画間の積荷の移行も捉えることに成功している．さらに，2種類の積荷（GPI-AP, VSV-G）を同時に輸送開始させて観察した．その結果，GPI-APどうしでは，少しの局在のズレは見られるものの，輸送過程全体を通して共局在し続けた（図3B）．一方，GPI-APとVSV-Gを同時に輸送開始すると，光照射直後から数分間は両者の部分的な共局在が観察されたが，10分経過した時点から，異なる局在を示すことがわかった．輸送開始後20分の時点では，両者はゴルジ体トランス槽を抜けた位置に明瞭に分離して蓄積しており，この領域から直接抜けていく様子が観察された．この観察結果と一致して，輸送に関わる経路の違いによって，TGN局在タンパク質のTGN内における局在領域が異なることが報告されている^8）．RudLOV法を用いた観察により，複数種類の積荷の輸送を同調的に開始させることで，ゴルジ体トランス槽を抜けた後TGNで局在する領域が積荷によって異なることを直接観察することに成功した．

図3 RudLOV法による積荷タンパク質のゴルジ体内輸送の観察

RudLOVコンストラクトを発現させたHeLa細胞の共焦点顕微鏡画像．ノコダゾール処理によりゴルジ層板を散在させている．（A）～（C）のいずれにおいても積荷Halo-tag （Sala Flour 650T）::GPI-APを緑，トランスゴルジマーカーGalT::iRFP713を青で示した．（A）TGNマーカーNeonGreen::Arl1（赤）とGPI-APの関係を観察した．GPI-APはArl1局在部位と一時的に共局在した後（黄矢印），Arl1局在部位を超えた領域に蓄積し（赤矢印，緑矢印），その後，抜けていった．（B）積荷NeonGreen::GPI-AP（赤）と積荷Halo-tag （Sala Flour 650T）::GPI-AP（緑）は輸送開始から終了まで部分的に共局在し続けた（黄矢印）．（C）NeonGreen::VSV-G（赤）と積荷Halo-tag （Sala Flour 650T）::GPI-AP（緑）は輸送開始直後は共局在したが（黄矢印），20分を過ぎると異なるゾーンに蓄積した（赤矢印，緑矢印）．スケールバー：1 µm．

我々は，RUSH法が抱えていた課題点を解決した新たな輸送開始実験法RudLOV法を開発し，これまでに明らかにされていなかった積荷の詳細な輸送経路の違いを明らかにした．輸送の同調性の高さから，複数種類の積荷の同時輸送観察など，より詳細な輸送過程の観察が可能となった．しかしながらRudLOV法にはまだ課題が残されている．現在確認されている積荷のうち，GPI-AP, VSV-G, TNFαは非常によく機能している一方で，E-cadherinやLamp1などは光照射量に対して輸送される量が少なく，さらにマンノース6-リン酸受容体（M6PR）などの積荷では輸送開始がうまく起こらないことがわかっている．RudLOV法の適用範囲を広げるために，これらの積荷間の差がどこからくるものなのかを理解することが重要である．また，RudLOV法を用いたin vivoへの応用についてはまだ検討できていないが，ショウジョウバエ網膜や線虫，また，ビオチンを細胞内に多く含んでいる酵母といった生物種には光照射による輸送開始誘導が有用であると考えられる．近年，輸送開始実験の普及によって培養細胞における輸送研究が急激に進歩しているのに対し，これらの手法を生体において利用した報告例はまだ少ない^9）．薬剤投与を必要としないRudLOV法は，生体を用いて輸送研究を進める上で画期的な手法となりうる．

本稿では，光照射により制御可能な輸送開始実験法RudLOV法の簡単な原理と実例について述べた．哺乳類細胞においては，輸送開始から完了まで1時間程度かかる．一度の実験にかかる時間の長さを考えたとき，実験時のハンドリングのしやすさは重要である．RudLOV法は試薬の投与も必要なく，ただ光を照射するのみで実験が可能な系であり，順次光照射を行うことで，一つのウェルで幾度も実験できる．また，その輸送同調性や領域指定の自由度の高さはより精度の高い実験結果を得る手助けとなるだろう．本稿で示した2種の積荷の同時輸送開始は，明確に経路の違いを示す上で重要であるのにもかかわらず，その報告例は少ない．RudLOV法を用いて複数種の積荷とマーカーの局在を同時に多色高解像度観察することで選別過程の詳細を明らかにできると期待している．汎用性に課題は残されているものの，発現させるだけで輸送を観察することが可能なRudLOV法は，あらゆる細胞種や生物種に応用可能なツールとなると期待している．