我々の研究グループは，甲状腺ホルモンが，刷り込みを成立・習得させるのみならず，その後のヒナの学習能力を飛躍的に向上させ，論理の逆転［反転学習（reversal learning）］やルールの変更［課題転換（task switching）］といった，哺乳類の前頭前野に相当する脳領域が担う高次の認知的柔軟性（cognitive flexibility）を獲得できることを示した10）．以下に我々の研究成果について解説する．
1）認知的柔軟性と甲状腺ホルモン
鳥類は哺乳類の認知能力に匹敵する高い能力を有する34–37）．その中でも，認知的柔軟性は，連合学習と作業記憶に基づいて，変化する状況を急速に認識し，新しい環境へ適切に反応することを可能にする能力のことである38）．認知的柔軟性は，ヒトにおいては加齢と経験を積むことによって発達すると考えられてきた39）．鳥類でも，たとえば成鳥のハトは，哺乳類でいう前頭前野に相当する脳領域による作業記憶や行動柔軟性などの認知能力を有する40–43）．また成鳥のニワトリでも，個体識別，観察学習，階層的な社会性の獲得などの能力を示すことが明らかにされている44, 45）．
一方で，家禽のニワトリやアヒルなど離巣性鳥類は，孵化前後から早熟な行動特性を示し，孵化日から眼を開けて歩行し，刷り込み1），biological motionへの選好性46），連合学習16），作業記憶47）や関係概念学習48）を含む認知機能36）を有する．したがって我々は，認知的柔軟性など，より複雑な認知機能も孵化直後からでも獲得される可能性があると考えた．
前節で述べたように，生理的には，ニワトリの脳内T3濃度は孵化前後にピークを迎える．さらに，刷り込み学習によって血管内皮細胞から脳内へのT3の急速な流入が促進され，T3濃度はさらに上昇する．T3濃度が閾値を超えると，学習臨界期を過ぎても刷り込み能力は維持される16）．さらに，刷り込み後に色と水報酬を関連づける連合学習課題の成績が高まる16）．つまり，刷り込みとは，単に母親や兄弟姉妹を記憶する学習であるだけでなく，後の学習に対する習得能力を付与する学習であるといえる．
一方で，就巣性の鳥類では，発声学習におけるT3の重要性が示唆されていた49, 50）．我々も，キンカチョウの発達期に，脳内でT3が一過性に上昇することを発見した51, 52）．これはオスの幼鳥が父鳥の歌をテンプレートとして記憶し始める巣立ちの時期と合致している．また，チロキシン（T4）をT3に変換する酵素であるDio2（ヨードチロニン脱ヨウ素酵素タイプ2）が，雄の歌の神経核（Area X, HVC，およびRA）において，感覚学習期である孵化後50日までに血管内皮細胞で高値を示す53）ことは，感覚学習期における甲状腺ホルモンの関与を示唆する．このように，学習臨界期のような限られた短期間に起こる甲状腺ホルモンの生理的な濃度上昇は，認知機能の発達に必要であるように思われる．
さらに鳥類におけるT3の役割に加え，甲状腺ホルモンは哺乳類学習の神経可塑性など，認知機能の獲得にも関与することも示唆されてきた54, 55）．げっ歯類では，T3の慢性的な欠乏により，空間記憶，恐怖学習，運動学習，感覚学習が障害される50）．一方，出生前後または出生後早期の甲状腺ホルモンの一過性の濃度上昇は，げっ歯類を含む哺乳類で示されている56, 57）．ヒトでは，T3およびT4の血清濃度は生後1～2日以内に増加し，生後7日目でも成体時より高い値を維持し，その後減少する58, 59）．これは，甲状腺ホルモンが生後間もない感覚学習やその他の脳機能の発達において積極的な役割を果たすことを示唆する．しかし通常，甲状腺ホルモン濃度は発達過程を通じて厳密に制御される必要があり，ある濃度範囲から長期に逸脱すると甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症が発生する．臨床報告によると，妊娠中の血清T4濃度の低下による甲状腺機能低下症は，出生児の知能指数の低下と関連している60, 61）．
2）社会的剥奪と認知的柔軟性
ニワトリヒナは，動物の幼少期の経験とその後の発達との相互作用を研究するための有用なモデルとなりうる．また，ニワトリヒナは，他の動物種に比べて刷り込みなど学習による実験結果を得るために要する時間が大幅に短くてすむ．さらに刷り込み学習を行わずに孵化後4日目まで暗黒下で飼育されたニワトリヒナは，刷り込み後に新奇な対象物に適切に接近できないなど，愛着障害の特徴を示す9）．一種の社会的剥奪といえる．これは，ヒトにおいて施設で育てられた生後6か月未満の子供が示す見知らぬ他者に対する反応62）と類似している．乳児期から幼年期にかけての前頭前野の発達は，認知的柔軟性の発達の前提条件である6, 63）．施設に入所した子供は，前頭前野と側頭葉を結ぶ脳神経領域において白質量が低下していた64）．この結果は，ハーロウらの孤立飼育したマカクザルを用いた実験結果とも類似している65）．我々は，このような背景から，ニワトリヒナを用いた学習研究が，ヒトを含む高等動物の母親からの愛着を研究するためのモデルとして使用できると考えた．
3）認知的柔軟性測定系の構築
我々は，ヒトの3歳から5歳児の認知的柔軟性を評価するカードソート法66）を参考に，刷り込み記憶を経験したニワトリヒナが，論理の逆転（反転学習）やルールの変更（課題転換）といった，哺乳類の前頭前野に相当する脳領域が担う認知的柔軟性を示すか否かを，1日の実験で調べることができる測定系を独自に構築した10）．
我々が開発した認知的柔軟性を調べる実験系は，生まれて4日齢のニワトリヒナが色と位置（場所）の違いを学習できることを利用している．ニワトリヒナは，正解の色と位置（場所）の棒をくちばしでつつくことで報酬の水をもらえることを学ぶ．これまで認知的柔軟性は，ヒトでは5歳程度までの経験，鳥でも成鳥になるまでの経験が必要となる能力と考えられてきた．我々は孵化後間もないニワトリヒナに認知的柔軟性が備わっているならば，刷り込みで重要な役割を果たしている甲状腺ホルモンが柔軟性にも関わっているのではないかと考えた．
4）刷り込みと認知的柔軟性
実験方法は以下のとおりである．まず孵化後1日目にヒナを刷り込む．次に，1日目に刷り込みを行ったあと暗黒下で飼育した4日目のヒナと，4日目まで刷り込みを行わずに暗黒下で飼育したヒナを用いて課題転換を行った．4日目まで刷り込みを行わずに暗黒下で飼育して社会的に隔離されたヒナは，刷り込みの臨界期がすでに閉じているため，もはや刷り込みができなくなっている16）．
課題転換は，最初に色の弁別，2番目に位置の弁別という二つの課題から構成されている（図1A）．
色弁別課題では，青と緑のビーズが動物に提示される．刷り込んだヒナと刷り込まなかったヒナを用意し，それぞれに対して，色弁別課題を課したヒナと課さなかったヒナに分けたので合計四つの条件が用意されたことになる．各セッションでは，ヒナが正しい刺激（あらかじめ正解と定めた青または緑ビーズをつつくと報酬の水がもらえる）を5回選択するまで試行を繰り返す．これを1セッションとし，合計5セッション実施した．すると刷り込みをしなかったヒナ（n＝31）では，最初のセッション終了後の平均正答率は65％であり，5回目のセッションになると81％に増加した（図1B）．このことは刷り込みをしなかったヒナでも色弁別課題が習得できたことを示す．一方，刷り込みを受けたヒナ（n＝28）の平均正答率は刷り込みしなかったヒナの正答率と有意差はなく，刷り込み経験は色弁別課題の習得率に影響を与えなかったことを示す．
次に，色弁別課題終了の1時間後に位置弁別課題を実施した．この条件では，課題は色弁別から位置弁別へと転換している．今度は，正解刺激の位置は左右のどちらかに固定され，動物間でカウンターバランスがとられた．位置弁別課題では7回のセッションを実施した．その結果，最初の色弁別課題実施前に刷り込みをしなかったヒナの平均正答率は50％から徐々に増加して，7回目のセッションでは65％になった（図1C）．それに対して，色弁別課題実施前に刷り込みをしたヒナの平均正答率は80％まで増加した．このことは，刷り込み学習をすることによって，課題転換後の学習の習得が上昇したことを示している．興味深いことに，刷り込みをしていても，色弁別課題を経験したヒナの平均正答率の方が，色弁別課題を経験しなかったヒナの正答率よりも高かった（図1C）．別途実施した刷り込みテストでは，刷り込みの強さ自体には，この二つのグループ間で差がなかった．以上の結果は，刷り込み経験による課題転換後の正答率の上昇は，色弁別課題での学習を経験したことに依存することを示している．刷り込みせずに色弁別課題だけを経験させても位置弁別課題における平均正答率は上昇しなかったことから，課題転換後の学習において，色弁別課題の経験を経たことによる促進効果がみられるためには，刷り込み経験による社会的愛着が必要であったことが示された．
5）甲状腺ホルモンと認知的柔軟性
次に，刷り込みを経験したことによる課題転換の促進が，T3の作用で説明できるかどうかを知るため，刷り込みの代わりに1日目にT3をヒナ静脈内に投与した（図1D）．すると1日目のT3投与は，課題転換後の位置弁別課題の成績を促進した（図1F）．これは，T3が刷り込みの代替となりうることを示す．またT3投与の効果は，色弁別課題を経験させることに依存していた（図1F）．さらにT3投与がない場合，色弁別課題を経験させても転換後の位置弁別課題の成績を促進しなかった（図1F）．
甲状腺ホルモンによる認知機能の向上作用が明らかになったことから，甲状腺ホルモンの生理的な動態を解析した．脳内のT3濃度は15日胚（E15）から増加し始め，孵化前後にピークに達し，その後徐々に減少することを以前我々は示している16）．我々は甲状腺ホルモン濃度の変動が，甲状腺における合成量に依存する可能性を考え，甲状腺の体内動態を解析した．甲状腺の大きさを推定するために，濾胞上皮細胞に発現する甲状腺ペルオキシダーゼ（TPO）のmRNAとタンパク質を，それぞれin situハイブリダイゼーションと免疫組織化学によって検出した．その結果，甲状腺の発達による大きさの変動はT3の脳内濃度変動と相関しており（図2A），孵化後の認知機能，特に刷り込みに必要なT3を供給していることが予想された．次に，刷り込み学習時に作用するT3によって，刷り込みとそれに続く課題転換の習得率が向上することを示すために，孵化後0日目と1日目のヒナにメチマゾール（MMI：甲状腺ホルモン生合成阻害剤）を静脈内に投与して，刷り込みとそれに引き続く課題転換に対する影響を調べた（図2B）．すると，MMIを注射したヒナの血清中のT4濃度は，リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を注射した対照群のヒナよりも低くなった（図2C）．また，刷り込みにおいても，MMI注射は刷り込みスコアを低下させた（図2D）．そして，課題転換においてMMI注射は位置弁別課題の平均正答率を低下させた（図2F）が，色弁別課題の平均正答率には影響を与えなかった（図2E）．その原因を精査すると，MMIを注射したヒナは色弁別課題において正解であった色のビーズを執拗に選択し続けていたため，位置弁別課題の正答率を低下させたことが示唆された．
6）甲状腺ホルモンの認知的柔軟性における作用点
我々は以前，暗所下で刷り込み学習臨界期を超える孵化後4日目または6日目まで飼育したヒナに対してT3を静脈内に注射すると，失われた刷り込み能力が回復することを報告した16）．我々は，孵化後4日目まで暗黒飼育したヒナにT3を注射した場合にも，T3による課題転換の促進が観察されるかどうかを調べた．すると予想どおり，T3注射は色弁別課題には影響を及ぼさなかったが転換後の位置弁別課題の平均正答率を向上させた．重要なことは，課題切り替えの順序を逆にした場合，すなわち位置弁別課題を先に行ったあとに色弁別課題を行った場合にも，後に行った課題においてのみ正答率の上昇が観察されたことである．この実験事実は，T3による正答率向上が，課題の順序によらず，課題の転換に依存することを示している．すなわち転換前の課題経験は，課題そのものの成績には影響しないものの，転換後の課題の成績上昇に寄与する何らかの神経回路レベルでの変化を引き起こした可能性がある．
7）甲状腺ホルモンと反転学習
我々は甲状腺ホルモンが反転学習に及ぼす影響についても解析した．課題転換の場合と同様に，反転によって正解が変更された場合にホルモンの効果が現れるのではないかと予想したためである．結果は，予想どおりT3投与後の反転学習では，連続した色弁別課題における正解の反転（青か緑の反転）であっても，連続した位置弁別課題における正解の反転（右か左の反転）であっても，反転後の課題においてT3投与による促進が顕著に検出された．しかし，正解を反転させずに連続した色弁別課題や連続した位置弁別課題を行った場合には，T3投与による促進効果は検出されなかった．これらの結果は，T3による促進効果は，反転や転換をヒナが感知し，新しい正解やルールに対して適応するメカニズムを脳内に有しているために表れたものと解釈した．
8）認知的柔軟性に必要とされる脳神経回路
認知的柔軟性が活性化するためには，刷り込みを駆動する神経回路が必要となる（図3）．刷り込みオブジェクトの視覚情報は，視床DLA（nucleus dorsolateralis anterior thalami）領域から，大脳IHA（interstitial nucleus of the hyperpallium apicale）領域，HDCo（core region of hyperpallium densocallulare）領域，HDPe（periventricular region of the hyperpallium densocellulare）領域を経てIMM領域に伝達される．
IMM領域からの情報は，主に三つの大脳IMHA領域，Arco（arcopallium）領域，Ni（nidopallium intermedium）領域を経て，哺乳類前頭前野相当のNdc（nidopallium dorsocaudale）領域に伝達されることにより，認知的柔軟性が発揮されると考えられる．
鳥類の感覚連合野であるIMM領域は，刷り込みの初期記憶に必要とされる．哺乳類の前頭前野に相当するNcl（nidopallium caudolaterale）領域67）は，磁気共鳴画像法（MRI）研究から，ニワトリの刷り込み記憶の想起に関与しており68），ハトの反転学習では，認知的柔軟性の発現に重要な脳領域の一つであると提案されている69）．ニワトリのNdc領域は，ハトのNcl領域と解剖学的に共通性を有する70）．すなわちニワトリのNdcは，ドーパミンおよびcAMPによって調節される分子量32,000のリン酸化タンパク質（DARPP-32）を発現している．これは，Ndc領域の神経が，ハトのNcl領域や哺乳類の前頭前野と同様にドーパミンD-1受容体を有することを示している．Ndc領域を欠損させると，認知的柔軟性は低下する．ニワトリヒナのNdc領域は刷り込み記憶の想起に関与しているが，Ndc領域を欠損したニワトリヒナは，課題転換後の位置弁別課題において，一貫して転換前の色弁別課題に基づいたビーズを選択し続け，転換によるルールの変更に適応できなくなった．また，IMM領域に直接T3を注入すると柔軟性が向上するが，Ndc領域にT3を注入しても向上しないことから，Ndc領域はIMM領域の下流でT3シグナルを受け取り，認知的柔軟性を高める脳領域であると考えられた．
1）認知的柔軟性は周生期の刷り込みのような初期学習を通じて獲得される
これまで，認知的柔軟性を獲得するためには，多くの学習経験を積む必要があり，ヒトの認知的柔軟性の場合，前頭前野の発達に伴い5歳程度から見いだされ，成人期までに徐々に発達すると考えられてきた39）．カラスなどの鳥類でも，認知的柔軟性を獲得するためには成鳥である必要があると考えられてきた．しかし，我々の発見は生まれたてのニワトリヒナであっても，刷り込みのような重要な学習を学習臨界期内に経験・習得すれば獲得できることを示している．認知的柔軟性は，これまで考えられてきたよりも少ない学習経験によって獲得されるものと考えられる．我々は，ヒトの幼児の認知機能評価法66）を参考に，新生ヒナの認知的柔軟性を評価するために，課題転換および反転学習を行わせる行動装置を開発した．その結果，刷り込みを受けていない，あるいはT3が欠乏して認知的柔軟性が低下したヒナにT3を注射することで，刷り込みを受けたヒナと同等の柔軟性を示すことを明らかにした．この結果は，新生ヒナであっても認知的柔軟性を相当程度まで獲得できることを示す．認知的柔軟性は，変化する状況を急速に認識し，新しい環境へ適切に反応することを可能にする能力とされる38）．我々は，周生期における肺呼吸の開始に伴う酸素消費の増加，卵内の暗所から明所への生活環境の変化，行動範囲の拡大など，認知的柔軟性の獲得は孵化前後に起こる大きな環境変化に対応するための生存戦略であると推察する．認知的柔軟性を早期に発達させることは，ヒナにとって重要なことであり，その能力を引き出す誘導因子として刷り込みの役割があるものと考えられる．
2）甲状腺ホルモンは脳機能に変化をもたらし課題転換と反転学習に適応させる
T3が認知的柔軟性に及ぼす効果を説明する可能性の一つ目は，T3が最初の色弁別課題において，正解の色を記憶し保持する能力を低下させたことである．その結果，ヒナの脳内で正解の色を弁別して記憶保持する力が弱まると，干渉が少なくなり課題転換後の成績が向上することになる．
もう一つの可能性は，T3によって課題転換後の位置弁別課題における新しい規則に対する識別力が促進されたことである．課題転換後の位置弁別課題では，色弁別課題において正解であった色の選択率は数回のセッションで低下するが，その選択率は刷り込みを受けた（またはT3を注入した）ヒナと刷り込みを受けていないヒナの間で差はなかった．しかし，位置弁別課題での正解の位置選択率は，刷り込みを受けた（またはT3を注入した）ヒナの方が刷り込みを受けていないヒナよりも早く上昇した．これは，刷り込みを受けた（またはT3を注入された）ヒナは，T3によって転換後の正解に適応していく能力を与えられたことを意味する．結果として課題転換後の成績は上昇する．
行動学的な観点からすると，T3による効果は転換または反転に依存して起こるので，ヒナは転換または反転を「予見」している可能性が高い．この「予見」は，知覚学習の一形態71, 72）と解釈できるかもしれない．ヒナは，繰り返し刺激に曝露されることによって，異なる色や位置を知覚的に識別することを学習する．また，「刺激の一つを選択することで報酬が得られる」といった，課題全体の概念構造の理解も含まれる可能性もある．
一連の実験において，新生ヒナは課題転換において，課題に関連する刺激の次元が色から位置へと転換することに適応する必要がある．一方，反転学習においては，一つの次元（色または位置）内でのルールの切り替えに適応する必要がある．刷り込みまたはT3投与は，両方の学習課題においてヒナの成績を向上させた．しかも甲状腺ホルモンによる成績上昇作用は，刷り込み経験に依存するとともに，転換前や反転前の課題にも依存して表れる．このように，甲状腺ホルモンは，刷り込みの学習臨界期を決定するだけでなく，発達初期における認知的柔軟性を支配する．甲状腺ホルモンは，脊椎動物の認知発達において進化的にも保存された認知刺激因子としての役割を果たしているのではないか．
3）甲状腺ホルモンは，鳥類の前頭前野を介して認知発達を促進する
新生ヒナが示す認知的柔軟性には，前頭前野であるNdc領域がきわめて重要である．T3による認知的柔軟性をつかさどる神経回路は，哺乳類の皮質内ネットワークと類似した点がある．Ndc領域のニューロンがD-1受容体およびセロトニン（5-HT）受容体を持つという証拠は，哺乳類の前頭前野73, 74）と同様に，ドーパミン作動性およびセロトニン作動性システム24）が認知的柔軟性に積極的な役割を果たすことを示唆する．
孵化前後のT3の生理的濃度上昇は，鳥類の感覚連合野であるIMM領域を介したメカニズムを介して新生ヒナに認知的柔軟性を付与する．IMM領域は，哺乳類の視覚野に類似した神経核（IHA）から視覚入力を受け取る．刷り込みにおいては，IHAからの情報がGABA神経を介してIMM領域で変換され，刷り込みを獲得する29）．我々は，Ndc領域が直接的または間接的にGABAおよびACh作動性神経を介して，IMM領域からT3シグナルを受け取る下流の脳領域である可能性を示した．T3の効果は，IMM領域からNdc領域のドーパミンおよびセロトニンニューロン24）に間接的に伝達され，認知的柔軟性を促進した可能性が高い．情報の中継点としては，大脳Arco領域，大脳Ni領域，大脳IMHA領域20）を経ることにより，IMM領域の視覚情報がNdcに伝達・修正され，認知的柔軟性が発揮されたものと考えられる．
4）甲状腺ホルモンによる認知機能の高度化は，進化の過程における環境変化への適応戦略であった可能性がある（表1）
表1 脊椎動物における甲状腺ホルモンの生理的サージの発生時期と認知機能| 分類 | 動物種 | 甲状腺ホルモンの一過性サージ | （予想）認知機能 |
|---|
| 鳥類 | 離巣性 | ニワトリ，ウズラ | 孵化（肺呼吸）17） | 刷り込み（視覚）16），認知的柔軟性10） |
| 就巣性 | キンカチョウ | 巣立ち（孵化後3週齢）28, 53） | 歌学習（聴覚） |
| 哺乳類 | 霊長類 | ヒト | 生後1週間59） | 刷り込み（嗅覚），認知的柔軟性 |
| げっ歯類 | マウス，ラット | 生後2週間56） | 位置認識，物体認識，位置順序認識 |
| 爬虫類 | ワニ，カメ，トカゲ，ヘビ | 孵化（肺呼吸）77） | 冬眠・繁殖期における認知77），性決定78），刷り込み |
| 両生類 | カエル | 変態期（肺呼吸）79, 80） | 環境適応（成体）79, 80） |
| 魚類 | サケ，マス | 銀化（スモルト化，変態）81, 82） | 環境適応（海水耐性）82），母川記銘・回帰（嗅覚）81） |
甲状腺ホルモンの化学構造は，すべての脊椎動物において進化的に保存されている．甲状腺は，過酸化水素とヨウ素を用いて甲状腺ホルモンを合成し，肺呼吸を含むさまざまな生理機能の発達およびエネルギー代謝の要求を満たす．これらの代謝的な要求は両生類の変態においても同様であり，カエルでは甲状腺ホルモン合成の明らかな増加が変態期にみられる75）．in situハイブリダイゼーションおよびイムノブロッティングによる組織学的解析を行った結果，ニワトリ甲状腺は胚発生後期に増大し，孵化直前にピークに達し，その後孵化後時間の経過とともに減少する（図2A）．これは，甲状腺の発達が甲状腺ホルモンの合成とリンクしていることを示唆する．ヒトでは脳が体全体のエネルギーの約20％を使用し76），さまざまな脳機能の発現に利用する．甲状腺ホルモンは，認知機能を発達させるホルモンとして進化的に選択されてきた可能性がある．肺呼吸の開始による酸素消費量の増大は，過酸化酸素など酸素が関与する生化学反応によって甲状腺ホルモンの生合成の増加に結びついたものと思われる．離巣性の鳥や爬虫類77, 78）の孵化，就巣性の鳥の巣立ち，両生類79, 80）の変態，魚類の体色の変化（銀化，スモルト化）81, 82）およびヒトとげっ歯類の出生後に，甲状腺ホルモンは一過的に濃度上昇する．このことが，脳の認知機能の発達に対応していることも考えられる．刷り込み，発声学習，および乳児の最初の学習など，甲状腺ホルモンが機能する時期は，動物種により異なるが，それぞれのエネルギー要求度に応じた形で個々の脊椎動物の進化を通じて保存されてきたのだろう．このように甲状腺ホルモンによって賦与される高度な認知能力は，進化上必要とされる環境変化に適応するための脊椎動物の戦略であると考えられる．
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