生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

細胞内には，膜で囲まれていない多くの非膜オルガネラ（membraneless organelles）が存在し，これらは特定の生体高分子の局所的な濃縮によって形成される．その形成原理として注目されているのが，液–液相分離（liquid–liquid phase separation：LLPS）である^{1, 2）}．LLPSとは，均一な液体中にある分子が，熱力学・動力学的な条件のもとで，相互作用により自発的に二つの相（高濃度相と低濃度相）へと分離する現象であり，まるで油と水が分かれるような性質を示す．この現象は，特に天然変性領域（intrinsically disordered region：IDR）や多価な相互作用ドメインを持つタンパク質によって駆動されることが多く，弱い相互作用の多数の組合わせ（π–π相互作用，静電気力，疎水性相互作用など）により，分子が選択的に濃縮され液相を形成する^3）．また，RNA分子もこの相分離に重要な役割を果たし，タンパク質とRNAの複合的なネットワークが液相の物理特性や選択性に寄与している^4）．

近年の研究により，このLLPSによって形成される液滴様構造［液滴（liquid droplets）］が，動的で可逆的な性質を持ち，細胞内の機能的区画化を通じて，ストレス応答，RNA代謝，転写制御，DNA修復など，さまざまな重要な生命現象に関与していることが明らかになってきた^1）．

さらに，LLPSは疾患の発症・進展にも深く関わるという知見が蓄積されてきている．LLPSが破綻すると，可逆的な液滴が不可逆な凝集体（病的液滴，病的非膜オルガネラ）へと移行することがあり，それがさまざまな神経変性疾患の病理に関与する可能性が示唆されている^5）．また，がんにおいても，転写因子やRNAスプライシング因子がLLPSを介して転写活性化ドメインや転写活性化複合体を形成し，異常な遺伝子発現を駆動することが報告されている^6）．

このように，LLPSは細胞内秩序の維持に不可欠な現象であると同時に，その破綻が神経変性や腫瘍化といった深刻な病態へとつながる可能性を持っている．これらのメカニズムの理解を深めるためには，LLPSによって形成される非膜オルガネラの構成因子を同定することが重要であり，そのための技術的なアプローチの確立が求められている^3）．一方で，LLPSはIDRや多価な相互作用モチーフを持つタンパク質・RNA分子どうしの弱くかつ多点的な相互作用によって駆動されるため，構成因子の結合様式はきわめて動的かつ一過性であり，この性質ゆえに，従来用いられてきた免疫沈降法（immnoprecipitation：IP）や架橋依存的な手法では，液滴内部の構成因子を網羅的に同定することが難しいという技術的課題があった．この技術的課題を補完するため，物理的な結合に依存しない“空間的近接”に基づく標識手法が注目されている．その代表例が，APEX法や，BioID法，TurboID法などによる生細胞内の近接依存的なビオチン化ラベリング法である^7–9）．これらの手法では，標的タンパク質にビオチンリガーゼやペルオキシダーゼを融合させることで，その近傍タンパク質のin situビオチン標識を可能とする．これらの手法によって，空間的近接因子を高感度にビオチンラベリングすることが可能となったが，外因性の融合タンパク質の発現が必要になる点や細胞毒性の問題といった技術的制限も存在する．そこで，LLPSによって形成される非膜オルガネラの構成成分を同定するもう一つの手法として，我々やほかの研究グループは，特異抗体を用いてターゲット構造近傍の分子をビオチン標識する手法を開発してきた^10–12）．この手法により，内因性因子を標的に標識することを含めたより柔軟なアプローチで標的を選択し，液滴の構成因子を網羅的に同定することに成功した．

抗体を用いたin situビオチン標識法は，液滴や凝集体について，そこに特異的に集積するタンパク質に対する抗体を用いて近接因子をビオチン標識することで，その構成因子を同定する方法である^10–12）．具体的な手法および原理について述べる（図1）．まず，細胞を免疫蛍光染色のようにパラホルムアルデヒド（PFA）で固定し，膜透過処理を行う．その後，液滴あるいは凝集体に特異的に集積するタンパク質に対する一次抗体を反応させ，さらにその一次抗体に対するhorseradish peroxidase（HRP）標識した二次抗体を反応させることで，目的の液滴あるいは凝集体にHRPを配置する．その後，ビオチンフェノールと過酸化水素（H₂O₂）を短時間添加することで，配置したHRPによりビオチンフェノールはビオチンフェノキシラジカルに酸化されるが，フェノキシラジカルは反応性が高く，半減期がきわめて短いため，HRP近傍に存在するタンパク質のみがビオチン標識される．この原理により，目的の液滴や凝集体に配置したHRPに近接するタンパク質，すなわち液滴や凝集体に存在している構成因子のタンパク質をビオチン標識することができる^10–12）．ビオチン化されたタンパク質は，ビオチンと親和性の高いストレプトアビジンビーズにより精製し，質量分析法を用いて網羅的な解析を行う．また，液滴や凝集体に存在するDNAやRNAについても，タンパク質複合体として同様の方法で精製することができ，次世代シークエンサーで網羅的な解析を行うことができる^10）．

図1 抗体を用いたin situビオチン標識法の実験の流れ／模式図

1）細胞固定～ビオチン化（10 cmディッシュスケール）

1. 1）固定：4％PFA 3 mLで細胞を10分間室温で処理し固定する．PBS 3 mLで3回洗浄する．
2. 2）膜透過：0.5％TritonX-100/PBS 3 mLで15分間室温処理し，膜透過処理を行う．PBSで2回洗浄する．
3. 3）ブロッキング：ブロッキングバッファー（10％ウマ血清＋10％BSA）3 mLで60分間室温で処理し，ブロッキングを行う．
4. 4）一次抗体反応：ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体3 mLを室温で60分間反応させる．0.3％TritonX-100/PBSで3回洗浄する．
5. 5）二次抗体反応：ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体に対応するHRPつき二次抗体（例：anti-mouse/rabbit IgG HRP）3 mLを室温・暗所で60分間反応させる．0.3％TritonX-100/PBS 3 mLで3回洗浄する．
6. 6）ビオチン化：ビオチン化バッファー（0.0015％H₂O₂，200 mMビオチンフェノール／PBS）3 mLで厳密に60秒間反応させる．0.3％TritonX-100/PBS 3 mLで3回洗浄し反応を止める．

*biotin-phenolやH₂O₂の濃度，ビオチン反応時間は適宜条件検討を行い免疫染色等で確認し最適化する．

2）細胞溶解液の調製～ビオチン標識タンパク質の精製

1. 1）上記細胞を1％SDS RIPAバッファー（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1％TritonX-100，0.5％デオキシコール酸，1％SDS＋プロテアーゼ阻害剤）1 mLで回収する．
2. 2）ソニケーション［Bioruptor（ソニック・バイオ社），high設定，30秒ON/30秒OFF，total 20分］を行う．
3. 3）95°Cで30分間加熱処理し脱固定する．
4. 4）20,000×gで10分間，4°Cで遠心し，上清を回収する．
5. 5）SDSを含まないRIPAバッファーを等量加え，細胞溶解液を2倍に希釈する．
6. 6）Benzonase処理（1 mM MgCl₂，20 unit Benzonase添加，37°Cで20分間反応）を行う．
7. 7）室温でSoftlink Soft Release Avidinビーズ（Promega社）を50 µL添加し，1.5時間ローテートさせ反応させる．2500 rpm遠心し，上清を捨てる．
8. 8）0.5％SDS RIPAバッファー，0.5 M NaCl RIPAバッファー，1.2 M NaCl RIPAバッファー，0.5％SDS RIPAバッファー，蒸留水の順に洗浄操作を行う．5分間ローテション→遠心（2,500 rpm，1分間）→上清除去，を繰り返す．
9. 9）ビーズを蒸留水1 mLで3回洗浄する．

以降は，一般的な質量分析法のサンプル精製方法に準じて質量分析用サンプルの精製を行い，質量分析を行いビオチン標識タンパク質の同定を行う．SILAC法（細胞培養レベルで安定同位体標識されたアミノ酸を取り込ませることでタンパク質を定量的に比較するプロテオミクス手法）と組み合わせることで，サンプル間比較の定量性が高まる．

1）内因性タンパク質を標的とした近位ビオチン標識が可能

ビオチン化による近接タンパク質同定の手法としては，これまで，ペルオキシダーゼを用いるAPEX法やビオチンリガーゼを用いるBioID法やTurboID法といった方法が開発されており，広く用いられている^7–9）．これらの既存の手法と，今回の抗体を用いたin situビオチン標識法との相違点について述べる．

まず，これらの方法は，いずれも近接因子をビオチン化する酵素を用いるが，酵素と目的タンパク質の融合タンパク質を作製し細胞内で発現させる必要がある^7–9）．一方，抗体を用いたin situビオチン標識法では，目的タンパク質を標的とする一次抗体を用いることで，酵素と目的タンパク質の融合タンパク質を必要とせず，内在性の目的タンパク質を標的にしてビオチン標識を行うことができる（表1）^10–12）．そのため，酵素を融合させることによるタンパク質の機能の変化や，相互作用の変化や細胞毒性を避けることができる．

また，DNA損傷時に形成されるγH2AX（リン酸化H2AX）の核内フォーサイに代表されるように，翻訳後修飾に依存して形成される構造体が存在するが^13），本法は抗体依存的な手法のため，翻訳後修飾を認識する抗体を用いることでこれらの構造体にも適用できる点が大きなメリットである．

一方で，抗体のパフォーマンスの違いが直接的に結果に影響する点は考慮しなくてはならない．抗体の特異性や，認識部位の違いによって得られる結果が変わる場合があるので，あらかじめ十分な検討が必要である．

2）固定細胞を使用した“スナップショット”解析が可能

従来のライブセルで行うAPEX法やBioID法などとは異なり，抗体を用いたin situビオチン標識法はホルムアルデヒド固定処理を施した細胞で行う．本法はビオチン化の原理としてはAPEX法と類似しているが，APEX法と異なり，H₂O₂を固定した後に添加するためH₂O₂への曝露による細胞毒性も避けることができる．本法は，免疫蛍光染色法の延長線上の操作で実施可能であり，免疫蛍光染色で見えている非膜オルガネラをそのまま“スナップショット”的に捕捉することができる点が特徴である．また，固定されたサンプルを使用するという特性から，疾患患者由来の病理標本組織などにも本法が適用できることが期待できる．一方で，固定処理に伴うノイズの増加には注意が必要である．適切な複数の対照実験と比較し，バックグラウンドシグナルを排除することで，真の近傍因子群を抽出することが可能となる．

抗体を用いたin situビオチン標識法の適用事例について紹介する．我々はこの手法を用いて，核内の非膜オルガネラであるカハール体や核小体，DNA損傷時に形成されるγH2AXフォーサイ，さらに神経変性疾患特有の細胞内病的凝集体について，構成因子の同定を行っている（図2）．

図2 抗体を用いたin situビオチン標識法の応用例

（A）HeLa細胞を用いてCoilin抗体によりin situビオチン標識し，ストレプトアビジン蛍光イメージングによりビオチン標識シグナルを可視化したところ，シグナルの一致が確認された．スケールバー：5 µm．（B）HeLa細胞にエトポシドを添加してγH2AX fociの形成を誘導し，γH2AX抗体を用いてin situビオチン標識し，ビオチン標識シグナルを可視化したところ，シグナルの一致が確認された．スケールバー：5 µm．

核内非膜オルガネラについては，カハール体および核小体のマーカータンパク質であるCoilinとFibrillarinを標的としてそれぞれの構成因子の網羅的同定を行い，既知の構成因子に加えて新規の候補因子を多数同定したと同時に，カハール体に関しては近傍に局在するゲノムDNAおよびRNAの同定も行い，同定したRNAとタンパク質のインタラクトームを明らかにした^10）．また，抗γH2AX抗体を用いてin situビオチン標識を行うことで，リン酸化修飾依存的な構造体であるγH2AXフォーサイ構成因子を同定することができた^10）．γH2AXフォーサイに限らず，本法を用いることで，ほかの翻訳語修飾依存的な構造体の解析が可能になると期待される．

凝集体を形成する神経変性疾患においても，本法を用いて凝集体の構成因子の同定を試みており，新規因子が多数同定されている（未発表）．他の手法でも同定を行った上で統計的に有意な一貫性を認めており，本法が細胞内構造体解析のアプローチの一つとして有用であることが示唆される．

非膜オルガネラの構成因子を同定することは，生理機能の研究のみならず，神経変性疾患をはじめとした疾患の病態メカニズムの研究においても重要性が増してきている．抗体を用いたin situビオチン標識法は，固定細胞における内在性タンパク質を標的とした空間ビオチン標識が可能であり，他の手法では困難な修飾特異的な解析や病理標本への応用において強みを発揮する．本法は，APEX法やBioID法，TurboID法とともに，液滴や凝集体の構成因子を同定するための選択肢をより広げるものである．それぞれの長所短所を見きわめながら使い分け，場合によっては併用することで，非膜オルガネラの実態解明に近づくことができるはずである．また，本法は，患者由来の病理組織標本のin situビオチン標識を実現できるポテンシャルを秘めている．本手法の病理組織標本への応用に向けては，いくつかの解決すべき課題がまだ残されている現状であるが，これが可能となれば，疾患における非膜オルガネラの機能解明に向けて大きく前進できると期待している．