生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

糖尿病は，インスリンの作用不足による慢性の高血糖状態を主徴とする代謝疾患群である．2024年の国際糖尿病連合の発表によると，世界の成人の9人に1人に相当する5億8900万人が糖尿病罹患者と推定され，日本も糖尿病罹患者数が多い国の一つであるなど，世界レベルで糖尿病の脅威が増大している．糖尿病患者の約90～95％を占める2型糖尿病は，インスリン分泌能の低下とインスリン抵抗性の増大により，インスリンが相対的に不足した場合に発症する．2型糖尿病に対する治療薬は，これまでに数多く開発されてきたものの，2型糖尿病罹患者の生活の質は非罹患者よりも低い傾向にあるため2型糖尿病はいまだ克服されたとはいえず，新しい治療法および予防法の開発が求められている．

近年，2型糖尿病を含む種々の疾患の病態生理において，リン脂質が注目されている．生体膜の主要成分であるリン脂質は，極性基と2本の脂肪酸の組合わせにより1000種類以上の分子種が存在する．リン脂質は，ホスホリパーゼAによって加水分解されることで脂肪酸が1本のリゾリン脂質となる．このリゾリン脂質は，リゾリン脂質アシル転移酵素（lysophospholipid acyltransferase：LPLAT）によって再びリン脂質に変換され，その際にリン脂質の多様性が形成される（リモデリング経路，図1）．LPLATはこれまでに14種類同定され，さまざまな生体機能や病態に関与することが注目されている．たとえば，アラキドン酸含有ホスファチジルイノシトールを産生するLPLAT11（別名lysophosphatidylinositol acyltransferase 1：LPIAT1, membrane-bound O-acyltransferase domain-containing 7：MBOAT7）の一塩基多型は，ヨーロッパの肥満患者の6割が有することや，その発現低下が代謝機能障害関連脂肪性肝疾患（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease：MASLD）の発症および増悪化を引き起こすことが報告されている^1）．

図1 リン脂質のリモデリング経路

リゾホスファチジルコリン（lysophosphatidylcholine：LPC）は，ホスファチジルコリン（phosphatidylcholine：PC）がホスホリパーゼAによって加水分解されることで生成される主要なリゾリン脂質であり，肝障害性を示すことや，糖尿病モデルマウスやMASLDの患者においてその含有量が増加していることが示されている^2–4）．筆者らは，LPLATを糖・脂質代謝の中心臓器である肝臓において高発現させることで，LPCからPCへの変換を制御することができれば，糖・脂質代謝異常を改善でき，2型糖尿病の治療につながると考えた．現在までに，LPCからPCへ変換可能なリゾホスファチジルコリンアシル転移酵素（lysophosphatidylcholine acyltransferase：LPCAT）活性を持つLPLATは複数報告されている．LPLAT8（別名LPCAT1）は肺や網膜などに高い発現を示し，パルミチン酸を含むPCを産生する^{5, 6）}．LPLAT9（別名LPCAT2）は好中球やマクロファージなどの免疫細胞に発現し，PCと類似した構造をもつリン脂質であり，炎症時などの細胞外刺激に応じて急激に産生される血小板活性化因子を生成する^{5, 7, 8）}．LPLAT12（別名LPCAT3）は広範囲に発現が認められるが，特に肝臓や小腸に発現し，その欠損マウスにおいてトリアシルグリセロールの蓄積が観察されるなど，脂質代謝に関与することが示されている^{5, 9, 10）}．LPLAT10（別名LPCAT4, lysophosphatidylethanolamine acyltransferase 2：LPEAT2）もまたLPCAT活性を持ち，がんや肝障害などの疾患への関与が報告されている^{11, 12）}．しかしながら，LPLAT10の生物学的な機能は十分に明らかとなっていなかったことから，筆者らは，肝臓においてLPCAT活性を上昇させるために高発現させるLPLATとして，LPLAT10に注目した．本稿では，機能が十分に解明されていなかったLPLAT10を肝臓において高発現させることで，2型糖尿病に対する治療効果を検討し，グルコース依存性インスリン分泌が促進したことを示した筆者らの研究について紹介する^13）．

まず，LPLAT10の臓器分布について調べるため，6週齢のC57BL/6オスマウスから臓器を摘出し，定量的RT-PCRを用いてLPLAT10の発現量を測定した．その結果，LPLAT10は主に大脳と精巣において高発現していることが示された．一方，肝臓におけるLPLAT10の発現レベルは低かった．

次に，マウスの肝臓においてLPLAT10を高発現可能なベクターを作製することとした．遺伝子導入ベクターには，レンチウイルスベクターやアデノ随伴ウイルスベクターなどさまざまな種類が存在し，用途によって使い分けられている．その中で筆者らは，肝臓にLPLAT10を高発現させるベクターとして，肝指向性の高いアデノウイルスベクター（adenovirus：Ad）ベクターを選択した．Adベクターは，既存のベクターの中で遺伝子導入効率が最も高いことや，大量のベクターが回収可能であることなど遺伝子導入ベクターとして多くの長所を有しており，近年では，新型コロナウイルス感染症に対するワクチンのベクターとしても使用されている．一方で，従来のAdベクターは，静脈内投与後にAdベクターにより産生されたウイルスタンパク質によって肝障害が引き起こされたり，導入された遺伝子の発現が減弱したりすることが問題となっていた．そこで本研究では，これらの問題をマイクロRNA（miRNA）による遺伝子発現制御機構を利用して克服するため，筆者らが大阪大学の水口，櫻井（現　近畿大学）らと開発した，改良型アデノウイルスベクター「Ad-E4-122aT」を用いて検討を行うこととした^{14, 15）}．Ad-E4-122aTは，AdベクターゲノムのE4遺伝子の3′非翻訳領域に，肝臓特異的なmiR-122aの完全相補配列を4コピー挿入したAdベクターである．Ad-E4-122aTはmiR-122aの完全相補配列の挿入により肝臓でのAd遺伝子の発現が大きく抑制されることで，従来型Adベクターよりも肝障害性が大きく軽減しており，長期にわたって高効率に導入遺伝子を発現可能という長所を有している（図2）．そこで，Ad-E4-122aTにLPLAT10を搭載したAdベクター「Ad-LPLAT10」を作製し，本検討に用いることとした．

図2 改良型アデノウイルスベクター「Ad-E4-122aT」の特徴

作製したAd-LPLAT10が，マウスの肝臓においてLPLAT10をどの程度高発現可能かを調べるため，2型糖尿病モデルマウスであるdb/dbマウスにAd-LPLAT10またはコントロールAdベクター（ルシフェラーゼ遺伝子を搭載したAdベクター）を尾静脈内投与した．Adベクター投与2週間後に肝臓を回収し，LPLAT10のmRNA量およびタンパク質量を測定した．その結果，Ad-LPLAT10群はコントロールAd群と比較して，LPLAT10 mRNAが約370倍高く発現しており，タンパク質レベルも顕著な増大を示した．一方で，骨格筋および精巣上体周囲脂肪組織におけるLPLAT10 mRNAレベルは，Ad-LPLAT10群とコントロールAd群において同程度を示した．したがって，作製したAd-LPLAT10は，マウスの肝臓特異的にLPLAT10を高発現可能であることが示された．

次に，肝臓内のLPLAT10の高発現により，リン脂質の量や組成がどのように変化したかを調べるため，Ad-LPLAT10投与後の肝臓内のリン脂質およびリゾリン脂質を液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry：LC-MS/MS）を用いて解析した．その結果，肝臓内のPCおよびLPCの総量は，Ad-LPLAT10群とコントロールAd群との間に有意な差はみられなかったが，PCおよびLPCの分子種に大きな変化がみられた．そこで，種々のPCおよびLPCの分子種について解析したところ，Ad-LPLAT10群はコントロールAd群よりもPC 40:7（2本の脂肪酸の炭素数の合計が40，二重結合の合計が7のPC）が2.4倍増加していた（図3A）．さらに，Ad-LPLAT10群はコントロールAd群よりも，PC 38:1, PC 40:1, PC 40:2, PC 40:3, PC 42:7, PC 44:12, LPC 20:1が有意に増加し，PC 36:5, PC 38:4, LPC 18:0, LPC 20:3, LPC 20:4, LPC 20:5が有意に減少していた（図3B）．したがって，肝臓においてLPLAT10を高発現させることで，肝臓内のPCおよびLPCの組成が変化し，特にPC 40:7が顕著に増加することが示された．

図3 肝臓内のPCおよびLPC

db/dbマウスにAd-LPLAT10またはコントロールAdを尾静脈内投与し，2週間後の肝臓内の（A）PCと（B）LPCの分子種をLC-MS/MSを用いて解析した．*p＜0.05 （Mann–Whitney U test）. N.D.: not detected. 文献13より図を一部改変した．

肝臓におけるLPLAT10の高発現が代謝に与える影響について検討するため，db/dbマウスにAd-LPLAT10を尾静脈内投与し，体重を8週間にわたって測定した．その結果，Ad-LPLAT10群とコントロールAd群の体重の増加レベルは同程度であった．

糖代謝について検討するため，尾静脈内投与から2週間後に空腹時血糖値およびインスリン量を測定した．その結果，コントロールAd群とAd-LPLAT10群における空腹時血糖値およびインスリン量はともに同程度を示した．耐糖能に対する影響を調べるため糖負荷試験を行ったところ，耐糖能が改善することが示され，2型糖尿病モデルマウスの症状が改善した．2型糖尿病患者においては，食後のインスリン分泌が十分でなく，食後高血糖を示すことが知られている．db/dbマウスを用いて糖負荷後のインスリン分泌量を経時的に測定し，安定したデータを得ることは技術的に難しいため，C57BL/6マウスを用いて糖負荷試験を行い，インスリン分泌量を測定した．その結果，Ad-LPLAT10群においてはコントロールAd群よりも糖負荷後30および60分の血糖値が有意に低値を示したことから，db/dbマウスでの検討と同様の結果が観察された．さらに糖負荷後のインスリン分泌量を測定したところ，Ad-LPLAT10群はコントロールAd群よりもインスリン分泌量が増加したことが示された．したがって，LPLAT10の高発現によって肝臓内のPCおよびLPCの組成を変化させることで，食後のインスリン分泌量が増加し，食後高血糖が抑制されることが示された．

次に，肝臓内のPCおよびLPCの組成変化が，膵臓からのインスリン分泌を増加させるメカニズムの解明を試みた．筆者らは，LPLAT10の高発現によって変動が認められた肝臓内のPCおよびLPCが血中に分泌され，膵臓に作用することで血糖レベルに反応してインスリン分泌が起きると考えた．まず肝臓内のLPLAT10の高発現によるPCおよびLPCの組成変化が，血中のPC・LPCにも影響を及ぼすか否かを調べるため，血清中のPCおよびLPCについてもLC-MS/MSを用いて測定した．血清中のPCおよびLPCの総量は，肝臓中と同様にAd-LPLAT10群とコントロールAd群との間に有意な差はみられなかった．また，Ad-LPLAT10群ではコントロールAd群よりもPC 40:7が2.2倍増加していたことをはじめ，血清中のPCおよびLPCの組成変化は肝臓内の変化と同傾向であることが示された．

血中に分泌されたPC・LPCを含むリン脂質およびリゾリン脂質が，膵臓からグルコース依存性インスリン分泌に影響を与えるかを検討した．Ad-LPLAT10投与後のマウス血清を用いて，グルコース濃度に応じてインスリンを分泌可能なマウスインスリノーマ細胞株であるMIN6細胞を一晩培養した．その後，高濃度グルコース条件下におけるインスリン分泌量を測定したところ，Ad-LPLAT10投与後のマウス血清を用いて培養した群は，コントロール群よりもインスリン分泌量が増加した．

次に，肝臓から分泌されたPCまたはLPCが，血中を介して液性因子のように膵臓に作用することでインスリン分泌量を増加させるか否かを検討した．本検討では，LPLAT10の高発現によって顕著な増加を示したPC 40:7に注目した．PC 40:7は，構造解析によりC18:1（オレイン酸）とC22:6［ドコサヘキサエン酸（docosahexaenoic acid：DHA）］から構成されるPCであることを確認した．そこで，まずオレイン酸をMIN6細胞に一晩作用させた後，低濃度（2.8 mM）または高濃度（20 mM）のグルコースを用いて培養したところ，オレイン酸の作用によるインスリン分泌量の増加は観察されなかった．次に，DHAをMIN6細胞に作用させ，同様の検討を行った．低濃度グルコース条件下においては，DHA作用群とコントロール群との間に有意な差はみられなかった．一方，高濃度グルコース条件下では，DHA作用群においてインスリン分泌量は増加し，またその分泌量は濃度依存性を示した．さらに，マウスから膵島を単離し，同様に検討を行った．その結果，高濃度グルコース条件下において，膵島にDHAを作用させた群はコントロール群よりもインスリン分泌量が2倍に増加したことが示された．したがって，肝臓におけるLPLAT10の高発現は，肝臓内のリン脂質の脂肪酸組成の変化を介してグルコース依存性インスリン分泌を促進すること，中でもPC 40:7に含まれるDHAが重要であることが示された（図4）．

図4 肝臓におけるLPLAT10の高発現が，膵臓からのグルコース依存性インスリン分泌を促進させるメカニズム

本稿では，2型糖尿病に対する新しい治療法を開発するため，リゾリン脂質をリン脂質に変換することでリン脂質の多様性を形成するLPLATの一つである「LPLAT10」に注目した筆者らの研究を中心に紹介した．LPLAT10は機能が十分に解明されていないLPLATであったが，改良型Adベクターを用いて肝臓においてLPLAT10を高発現させることにより，LPLAT10が産生する肝臓内のリン脂質（特にDHA含有PC）が食後のインスリン分泌を増加させることで，食後の高血糖を抑制することを見いだした．すなわち，臨床応用を考えた場合，患者が高血糖になって初めて血糖値を下げる効果を示すことが考えられ，2型糖尿病治療薬の主な副作用である低血糖を回避可能であると期待される．したがって，LPLAT10を肝臓において高発現可能な医薬品や活性化剤，遺伝子治療法の開発が，新たな糖尿病治療薬につながることが期待される．

リン脂質は多数の分子種が存在し，それぞれが固有の機能を有するものと考えられている．また，リン脂質の脂肪酸組成の変化と，代謝性疾患やがんなどさまざまな疾患の関連が盛んに報告されている．今後，リン脂質の多様性と生命現象が明らかとなり，疾患治療への応用を進めることで，新しいタイプの治療および予防法の開発につなげていきたい．