生化学 SEIKAGAKU
Journal of Japanese Biochemical Society

エクソンの選択的な組合わせによって一つの遺伝子から複数の転写産物を生み出す選択的スプライシングは，真核生物のプロテオーム多様性を生み出す重要な機構である．ヒトでは約95％の遺伝子が選択的スプライシングを受けるとされ，発生・分化から疾患に至るまで広範な生命現象に関与している^1）．選択的スプライシングには，カセットエクソン，選択的5′スプライス部位，選択的3′スプライス部位，相互排他的エクソン，イントロン保持の五つの主要型が知られており（図1），近年ではRNA-Seqによりこれらのイベントを網羅的に解析することが容易になった^{2, 3）}．この過程は，mRNA前駆体上のシス配列（エクソン／イントロン配列中のエンハンサーやサイレンサー配列）とトランス因子（SRタンパク質やhnRNPタンパク質などのスプライシング因子）の相互作用によって厳密に制御されることが知られている．

図1 主要な選択的スプライシング様式の分類

エクソンの選択様式に基づく代表的な5種類のスプライシング形式を示す．（A）カセットエクソン（exon skipping），（B）選択的5′スプライス部位（A5SS），（C）選択的3′スプライス部位（A3SS），（D）相互排他的エクソン（MXE），（E）イントロン保持（IR）．

ポストゲノム時代を迎え，多種多様なノンコーディングRNA（noncoding RNA：ncRNA）の存在が明らかになった．近年，mRNA前駆体の選択的スプライシングが，従来考えられてきたタンパク質性スプライシング因子だけでなく，ncRNAによっても制御されることが明らかになりつつある．核内に豊富に存在する長鎖ノンコーディングRNA（long noncoding RNA：lncRNA）の一部は，スプライシング因子の活性や局在を変化させることでエクソン選択に影響を与える．たとえばMALAT1は核スペックルに局在し，SRタンパク質群の利用状態を調節することでスプライシングパターンを変えることが報告されている^4）．加えて，核小体低分子RNA（small nucleolar RNA：snoRNA）のプロセシングによって生じるlncRNAであるsno-lncRNAがスプライシング因子Fox2タンパク質の足場として働くなど，RNA自体がスプライシング装置の一部として機能する例が蓄積してきた^5）．

近年，スプライシング制御に関わるlncRNAが相次いで見つかり，RNAが“標的配列の認識”と“スプライシング因子の配置”を同時に担う制御モジュールとして働くという共通原理が浮かび上がってきた．これらのRNAは，特定の前駆体mRNAに対して相補的に結合し，そこへスプライシング因子を集中的にリクルートすることでエクソンの選択を変化させる．この原理は，アポトーシス，がん，転写制御，さらにはトランスポゾン挿入を介した機能獲得など，多様な例で確認されており，スプライシング制御ネットワークにおけるlncRNAの役割が明らかになりつつある．

さらに筆者らの共同研究グループは，RNAポリメラーゼIII（Pol III）によって転写される短鎖ncRNAである4.5SH RNAが，マウスにおいてSINE B1由来の有害なエクソン化を抑制することを見いだした（後述）^6）．

本稿では，このような「RNAが自ら標的mRNA前駆体をとらえ，スプライシング調節因子を局所的に呼び込む」という共通原理に注目し，lncRNAであるSafやPLANE, Alu挿入により機能を獲得した5S-OT，そしてPol III産生の4.5SH RNAを順に取り上げる．これらの比較を通じて，スプライシング制御性RNAの構造的モジュール性と進化的多様性を整理し，最後に内在性スプライシング制御RNA（splicing regulatory RNA：srRNA）という概念の拡張を論じる．

lncRNAの中には，特定のmRNA前駆体に結合して選択的スプライシングを調節するものが存在する^7–12）（表1）．その代表例として，Fas遺伝子（Fas受容体／CD95をコード）の発現制御に関わるSaf（Fas-antisense RNAとも呼ばれる）と，がん細胞で発現誘導されるPLANE，そしてトランスポゾン挿入により機能を獲得した5S-OTという三つのlncRNAを紹介する．

1）Saf（Fas-antisense RNA）

SafはFas遺伝子第1イントロン内に存在するプロモーターから転写される約1.5 kbのlncRNAであり，Fas遺伝子に対する天然のアンチセンスRNAとして位置づけられる．Safは核内に局在し，まず標的となるFas mRNA前駆体と部分的に相補的な塩基対を形成する^13）．加えてSafはスプライシング因子SPF45（RBM17）と直接結合し，Fas mRNA前駆体上にSaf–SPF45–mRNA前駆体の三者複合体を形成する．この複合体はFas mRNA前駆体のエクソン6のスプライシング因子による認識を抑制するため，エクソン6がスキップされた短縮型転写産物（FasΔEx6）が増加する．エクソン6は膜貫通ドメインをコードするため，このスプライシング変化により可溶性Fas受容体（sFas）が産生され，sFasが膜結合型Fasと競合することでFasリガンドによる細胞死シグナルが弱まる．実際にSafを過剰発現させた細胞ではsFasの増加とアポトーシス抵抗性の上昇が観察され，逆にSafをRNAiで低下させるとsFasは減少する．これらの結果から，SafはアンチセンスlncRNAとして標的mRNA前駆体に直接結合し，特定のスプライシング因子を局所的にリクルートすることでエクソン排除を促進する分子機構を持つと考えられる（図2A）^9）．

図2 srRNAの作用機序

（A） SafによるFasエクソン6の排除機構．SafはFas前駆体mRNAと部分的に相補的に結合し，同時にSPF45をリクルートすることでエクソン6の認識を阻害し，可溶性Fas（sFas）を生じるスプライシングスイッチを誘導する．（B） PLANEによるNCOR2スプライシング調節．PLANEはNCOR2前駆体mRNAのイントロン45に相補的に結合し，hnRNP Mを局所的に配置することでスプライシングを抑制し，主要アイソフォームNCOR2-202の産生を減少させる．（C） 4.5SH RNAによるasB1由来有害エクソンの抑制．4.5SH RNAは5′のステムループ（エフェクターモジュール）でhnRNP Mと結合し，3′側（標的認識モジュール）でasB1配列と相補的に結合する．これらの複合体が標的エクソンへのスプライシング因子アクセスを妨げ，エクソン化を抑制する．（D）プログラマブルなスプライシング制御RNAとしての応用．4.5SH RNAの標的認識モジュールを人工配列に置換することで，任意のエクソンに対してスキップを誘導できる．

2）PLANE

PLANE（pan-cancer lncRNA activating NCOR2 responsive to E2F1）はヒト染色体3qにコードされるおよそ1 kbのlncRNAで，がん患者由来の腫瘍組織および複数のがん細胞株のいずれにおいても，正常組織に比べて一貫して高発現していることが報告されている．この高発現は，3q29領域のコピー数増加と，プロモーターに結合するE2F1による転写活性化の双方によって駆動されると考えられている．Tengらは，PLANEが核内受容体や転写因子の転写抑制を担うコリプレッサーであるNCOR2遺伝子の特定のスプライシングイベントを抑制することで，がん細胞の増殖や腫瘍形成能に寄与することを示した．PLANEは核内でNCOR2 mRNA前駆体のイントロン45領域に相補的に結合し，同時にRNA結合タンパク質であるhnRNP Mをこの部位へリクルートする．PLANEとhnRNP Mが形成する複合体は，そのイントロンでのスプライシングを抑制するように働き，その結果，NCOR2の主要アイソフォームの一つであるNCOR2-202の生成が低下する（図2B）．NCOR2は甲状腺ホルモン受容体やレチノイン酸受容体などの核内受容体の転写抑制に関与するため，その発現量が低下すると転写抑制が弱まり，がん細胞の増殖が有利になると考えられる．PLANE遺伝子座は複数のがん種で増幅しており，PLANEの高発現とNCOR2のスプライシング異常・発現低下が対応することから，PLANEはがんにおけるスプライシング依存的なlncRNA制御因子と位置づけられる^8）．

3）Alu挿入型lncRNA（5S-OT）

lncRNAの中には，進化の過程でレトロトランスポゾンの挿入を受けた結果，新たなスプライシング制御能を獲得したものがある．5S-OT（5S rRNA overlapping transcript）はその代表例である．5S-OTは5S rDNAクラスターからPol IIにより転写されるlncRNAで，5S rRNA配列と一部オーバーラップしつつ3′末端にポリAを持つ．5S-OTはもともと5S遺伝子座近傍のクロマチンに結合してPol IIIによる5S rRNA転写を促進するというシス作用があるが，ヒト5S-OTにはさらに霊長類特異的なAlu配列（ヒトゲノムに多く存在する約300塩基の短い反復配列）がアンチセンス向きに挿入されている．Huらは，このAlu配列の獲得によってヒト5S-OTが多数のmRNA前駆体のスプライシングをトランスに制御できるようになったと報告した^1）．ヒト細胞で5S-OTをノックダウンすると，200前後のエクソンでスキップ率が変化する一方，遺伝子全体の発現量の変化は比較的限定的である．これは5S-OTが広範なスプライシングイベントに対して“微調整”をかけていることを示唆する．

分子機構としては，5S-OTがイントロン内のAlu配列と相補的に対合してAlu–Alu二重鎖を形成し，標的mRNA前駆体に結合すると考えられる．このAlu配列にはU-richな配列が含まれており，これがポリピリミジン（Py）ストレッチとして機能することで，スプライシング因子U2AF65の結合基盤を提供する．その結果，U2AF65が標的mRNA前駆体上に配置され，特定の3′スプライス部位の利用が調節されると推定される．興味深いことに，マウス5S-OTはこのAlu由来のポリピリミジン（Py）ストレッチ配列を欠くため，標的RNA上でU2AF65をリクルートできず，ヒト型のような広域スプライシング制御能を示さない．したがって5S-OTは「保存されたlncRNAがトランスポゾン挿入によってスプライシング制御という新機能を獲得した」例として位置づけることができ，系統特異的なスプライシングプログラムの進化を理解する上で重要である．また，5S-OTは同じ座のPol III転写（5S rRNA）を制御するシス作用と，他遺伝子のスプライシングを変えるトランス作用という二重の機能を持つ点でも特異的であり，転写とスプライシングの結合を1本のRNAで実現している点が注目される．そして5S-OT内のAlu配列を任意のイントロン配列へ置換することで，プログラマブルなスプライシング調節因子として機能することも示されている^11）．

Pol II由来のlncRNAに加え，近年ではRNAポリメラーゼIIIによって産生される短鎖ncRNAにもスプライシング制御機能を持つ分子が存在することが明らかとなっている．その代表例が，マウスやラット，ハムスターなどの小型齧歯類特異的に存在する4.5SH RNAである．4.5SH RNAは約90塩基の短鎖ncRNAで，1970年代にラット核内の低分子RNAとして初めて同定された^{14, 15）}．配列解析の結果，このRNAはマウスSINE B1と高い相同性を示す．SINE B1は，齧歯類ゲノムに多数存在するレトロトランスポゾン由来の短い反復配列で，霊長類のAlu配列に相当する要素である．4.5SHは，そのB1配列が約5000万～8500万年前にコピーされて生じたと推定されている．B1に特徴的なAリッチな3′末端（ポリアデニル化配列）が欠如しているため転移能は失われているものの，ゲノム中に多数のコピーが存在し，Pol IIIによる高い発現量で恒常的に蓄積することが特徴である．

長らく生理機能は不明であったが，細胞内局在解析により4.5SH RNAが核スペックルに特異的に局在することが示され，スプライシング調節への関与が示唆された^16）．筆者らの共同研究グループは4.5SH RNAノックアウト（KO）マウスを作製し，胚が発生初期に致死となることを明らかにした^6）．この結果は，4.5SH RNAが齧歯類において種特異的かつ発生に必須のncRNAであることを示す．

RNA-Seq解析の結果，4.5SH KO細胞ではSINE B1由来のasB1（アンチセンスSINE B1）有害エクソンが多数の転写産物に異常挿入されることが明らかとなった．通常，これらの潜在的に有害なエクソンはスプライシング機構によって認識・排除されるが，4.5SH RNAの欠如により抑制が破綻し，未成熟終止コドンの導入やフレームシフトが生じ，タンパク質産生に重大な影響を及ぼす．以上の知見は，4.5SH RNAが内在性srRNAとして機能し，有害エクソン化を抑制する役割を担っていることを示している．

その分子機構は，5S-OTと同様に，4.5SH RNAが二つの機能モジュールを持つ点にある（図2C）．下流側にはターゲット認識モジュールがあり，配列の一部（約60塩基）がasB1配列と相補的に対合することで，前駆体mRNA中の標的エクソンを直接認識する．一方，上流側にはエフェクター結合モジュールが存在し，5′末端の安定なステムループ構造がhnRNP Mをはじめとするスプライシング抑制因子と結合する．これらが複合体として標的エクソンにリクルートされることで，スプライシング装置によるasB1エクソンの認識が阻害され，エクソンスキップが誘導される．

さらに，このモジュール構造の理解を基盤として，エフェクターモジュール（5′ヘアピン構造）はそのまま保持してhnRNP Mリクルート能を維持しつつ，標的認識モジュールの配列のみを人工的に改変することで任意のエクソンをスキップさせる技術が開発されている（図2D）．筆者らはこの戦略により，Fas mRNA前駆体のエクソン6を認識する改変型4.5SH RNAを作製し，前述のSafと同様に，エクソンのスキップを誘導することに成功した．さらに，デュシェンヌ型筋ジストロフィーの原因遺伝子であるジストロフィンDMDに対しても同様のアプローチが有効であり，標的エクソンの選択的スキップが可能であることを示している^17）．

この改変型4.5SH RNAは，既存のアンチセンス核酸医薬と原理を共有しつつも，内在性RNAに近い安定性と動作様式を持つ点で優位性を持つ．今後の応用に向けては，ヒト細胞での機能性や標的特異性，RNA送達技術などの課題解決が求められるものの，スプライシング異常疾患に対する新規RNA医薬プラットフォームとして大きな可能性を秘めている^6）．

本稿では，SafやPLANE, 5S-OT，そして筆者らが明らかにした4.5SH RNAを例に，「RNA自身がスプライシング制御の主体となる」という共通原理を整理した．SafやPLANEはアポトーシスやがんに関わるスプライシングスイッチを担い，5S-OTはトランスポゾン挿入を契機として新たなスプライシング制御能を獲得した．一方，4.5SH RNAはPol III由来の短鎖ncRNAが種特異的なスプライシング恒常性の維持因子として働くことを示した点で特に特徴的である．

これらの知見は，スプライシング制御が従来想定されていた「タンパク質主体のネットワーク」だけでなく，ncRNAを中心とする階層的な調節系によって支えられていることを明らかにした．すなわちRNAは単なる遺伝子発現の中間分子ではなく，核内で高度に組織化された制御因子としても機能しうる．

さらに，5S-OTや4.5SH RNAの機能解析からは，標的認識部位を人工的に書き換えることで任意のエクソンを操作できる「プログラマブル性」を備えていることもみえてきた．5S-OTではAlu配列を別のイントロン配列に置換することで標的を転換でき，4.5SH RNAではasB1認識部位を改変することでFasやDMDなどヒト遺伝子のエクソンスキップを誘導できる．これらは，生物種ごとに進化したsrRNAの枠組みを応用し，設計可能なRNAによるスプライシング制御を実現しうることを示した点で興味深い．

今後，網羅的なRNA–タンパク質相互作用解析や機能スクリーニングの進展により，まだ知られていないsrRNAが多数見つかると考えられる．これらの発見は，スプライシング制御の理解を深めるだけでなく，標的エクソンをRNAで自在に操作する新しいRNA制御技術の基盤にもつながるだろう．